مقدمه
محیط ائوزین متیلن بلو (EMB) یکی از پرکاربردترین محیط‌های کشت انتخابی و تمایزی در میکروبیولوژی است که برای شناسایی باکتری‌های گرم منفی، به‌ویژه اعضای خانواده انتروباکتریاسه طراحی شده است. این محیط به دلیل ترکیب منحصربه‌فرد ائوزین Y، متیلن بلو و لاکتوز، توانایی مهار رشد باکتری‌های گرم مثبت و تمایز باکتری‌های گرم منفی بر اساس توانایی تخمیر لاکتوز را دارد. ویژگی‌های کلنی‌های باکتری‌ها روی EMB، مانند شکل، اندازه، رنگ و بافت، اطلاعات اولیه ارزشمندی برای شناسایی پاتوژن‌های روده‌ای، ادراری و بیمارستانی فراهم می‌کنند.
محیطEMB به‌طور خاص برای شناسایی باکتری‌هایی مانند اشرشیا کلای، کلبسیلا پنومونیه ، سالمونلا و شیگلا در نمونه‌های بالینی مانند مدفوع، ادرار و سواب‌های زخم استفاده می‌شود. تمایز باکتری‌ها روی این محیط بر اساس تولید اسید از تخمیر لاکتوز و واکنش رنگ‌های ائوزین و متیلن بلو انجام می‌شود، که منجر به ایجاد کلنی‌های متمایز (تیره با درخشش فلزی برای تخمیرکننده‌های لاکتوز و بی‌رنگ برای غیرتخمیرکننده‌ها) می‌شود.
ویژگی‌های کلنی باکتری‌ها روی EMB آگار
ویژگی‌های کلنی روی EMBشامل شکل، اندازه، رنگ، بافت و حاشیه، اطلاعات اولیه برای شناسایی باکتری‌های گرم منفی را فراهم می‌کنند. در ادامه، ویژگی‌های کلنی‌های باکتری‌های مهم بررسی می‌شود.
الف. باکتری‌های تخمیرکننده لاکتوز
- اشرشیا کلای:
شکل کلنی: متوسط (۲-۳ میلی‌متر)، گرد، صاف، با حاشیه مشخص.
رنگ: بنفش تیره تا سیاه با درخشش سبز فلزی به دلیل تولید اسید بالا.
بافت: مرطوب و براق.
کاربرد تشخیصی: درخشش سبز فلزی ویژگی شاخص E. coli در نمونه‌های ادرار و مدفوع است، که شایع‌ترین عامل عفونت‌های ادراری و اسهال را نشان می‌دهد.
- کلبسیلا پنومونیه:
شکل کلنی: بزرگ (۳-۴ میلی‌متر)، گرد، مرطوب، موکوئیدی (به دلیل کپسول پلی‌ساکاریدی)
رنگ: بنفش تیره تا سیاه، بدون درخشش فلزی.
بافت: چسبناک و موکوئیدی.
کاربرد تشخیصی: شناسایی در عفونت‌های تنفسی، ادراری و بیمارستانی، به‌ویژه در بیماران بستری.
- انتروباکتر:
شکل کلنی: متوسط تا بزرگ (۲-۴ میلی‌متر)، گرد، صاف یا کمی برجسته.
رنگ: بنفش تیره یا سیاه، گاهی با مرکز خاکستری.
بافت: مرطوب و صاف.
کاربرد تشخیصی: شناسایی در عفونت‌های بیمارستانی مانند سپتی‌سمی و عفونت‌های زخم.
- سیتروباکتر:
شکل کلنی: متوسط (۲-۳ میلی‌متر)، گرد، صاف.
رنگ: بنفش تیره تا سیاه، گاهی با حاشیه روشن.
بافت: صاف و مرطوب.
کاربرد تشخیصی: شناسایی در عفونت‌های ادراری و گوارشی، اگرچه کمتر شایع است.
ب. باکتری‌های غیرتخمیرکننده لاکتوز
- سالمونلا:
شکل کلنی: متوسط (۲-۳ میلی‌متر)، گرد، صاف، با حاشیه مشخص.
رنگ: بی‌رنگ یا شفاف، گاهی با ته‌رنگ صورتی کم‌رنگ.
بافت: صاف و خشک‌تر نسبت به کلنی‌های تخمیرکننده.
کاربرد تشخیصی: شناسایی در نمونه‌های مدفوع برای تشخیص سالمونلوز و تب تیفوئید.
- شیگلا:
شکل کلنی: کوچک تا متوسط (۱-۲ میلی‌متر)، گرد، صاف.
رنگ: بی‌رنگ یا شفاف.
بافت: صاف و خشک.
کاربرد تشخیصی: شناسایی در اسهال خونی (دیسانتری) از نمونه‌های مدفوع.
- پروتئوس:
شکل کلنی: متوسط (۲-۳ میلی‌متر)، با الگوی پخش‌شونده (Swarming) در برخی سویه‌ها.
رنگ: بی‌رنگ یا خاکستری.
بافت: صاف یا کمی ناهموار.
کاربرد تشخیصی: شناسایی در عفونت‌های ادراری، به‌ویژه در بیماران با کاتتر.
- سودوموناس آئروژنوزا:
شکل کلنی: بزرگ (۳-۵ میلی‌متر)، نامنظم، با حاشیه ناصاف.
رنگ: بی‌رنگ یا شفاف، گاهی با رنگدانه سبز (پیوسیانین) که محیط اطراف را رنگی می‌کند.
بافت: صاف یا کمی چرب.
کاربرد تشخیصی: شناسایی در عفونت‌های زخم، تنفسی و بیمارستانی، به‌ویژه در بیماران مبتلا به فیبروز سیستیک.
ج. سایر باکتری‌ها
- سراشیا مارسیسنس:
شکل کلنی: متوسط، گرد، صاف.
رنگ: گاهی بنفش تیره (در صورت تخمیر لاکتوز) یا بی‌رنگ، ممکن است رنگدانه قرمز (prodigiosin) تولید کند.
کاربرد تشخیصی: شناسایی در عفونت‌های بیمارستانی.
- یرسینیا انتروکولیتیکا:
شکل کلنی: کوچک (۱-۲ میلی‌متر)، گرد.
رنگ: بی‌رنگ یا شفاف.
کاربرد تشخیصی: شناسایی در عفونت‌های گوارشی.
ویژگی‌های افتراقی غیرکلنی
علاوه بر شکل و رنگ کلنی‌ها، سایر ویژگی‌ها نیز به تمایز باکتری‌ها روی EMB کمک می‌کنند:
- تولید رنگدانه: سودوموناس آئروژنوزا ممکن است پیوسیانین (سبز) و سراشیا مارسیسنس پرودیژیوسین (قرمز) تولید کنند.
- حلالیت محیط: کلنی‌های تخمیرکننده لاکتوز به دلیل تولید اسید، محیط اطراف را تیره‌تر می‌کنند.
- بوی مشخص: برخی باکتری‌ها مانند پروتئوس بوی آمونیاکی و سودوموناس بوی شیرین تولید می‌کنند.
- رفت کلنی: الگوی Swarming در پروتئوس و کلنی‌های موکوئیدی در کلبسیلا ویژگی‌های تشخیصی هستند.
پروتکل عملی استفاده از EMB آگار
جمع‌آوری نمونه: نمونه‌های مناسب شامل مدفوع، ادرار، خلط، سواب زخم یا خون هستند.
کشت: استفاده از روش استریک چهارگانه برای جداسازی کلنی‌های منفرد.
انکوباسیون: پلیت‌ها در دمای ۳۵-۳۷ درجه سانتی‌گراد به مدت ۲۴-۴۸ ساعت انکوبه می‌شوند.
تفسیر نتایج:
- کلنی‌های تیره با درخشش سبز فلزی: E. coli
- کلنی‌های تیره موکوئیدی بدون درخشش: کلبسیلا یا انتروباکتر
- کلنی‌های بی‌رنگ یا شفاف: سالمونلا، شیگلا، پروتئوس یا سودوموناس
کاربردهای بالینی
- تشخیص پاتوژن‌های روده‌ای: شناسایی E. coli، سالمونلا و شیگلا در نمونه‌های مدفوع برای بیماری‌های اسهالی.
- عفونت‌های ادراری: شناسایی E. coli، کلبسیلا و پروتئوس در نمونه‌های ادرار.
- عفونت‌های بیمارستانی: تشخیص کلبسیلا، سودوموناس و انتروباکتر در عفونت‌های تنفسی و زخم.
- تحقیقات اپیدمیولوژیک: بررسی شیوع سویه‌های مقاوم مانند E. coli تولیدکننده بتالاکتاماز
محدودیت‌ها
- تداخل فلور نرمال: فلور لاکتوز مثبت (مانند E. coli غیرپاتوژن) ممکن است شناسایی پاتوژن‌های لاکتوز منفی را در نمونه‌های مدفوع دشوار کند.
- رشد ضعیف برخی گونه‌ها: شیگلا ممکن است کلنی‌های کوچک و کم‌رشد تولید کند.
- نیاز به تست‌های تأییدی: شناسایی اولیه باید با روش‌های بیوشیمیایی یا مولکولی تأیید شود.
- وابستگی به کیفیت محیط: کیفیت مواد اولیه و آماده‌سازی می‌تواند بر وضوح کلنی‌ها تأثیر بگذارد.
نتیجه‌گیری
محیط EMB آگار با ایجاد کلنی‌های متمایز، ابزاری کلیدی برای شناسایی باکتری‌های گرم منفی در آزمایشگاه‌های میکروبیولوژی است. ویژگی‌های کلنی مانند شکل، رنگ، بافت و حاشیه، همراه با تولید رنگدانه یا الگوهای خاص (مانند درخشش سبز فلزی E. coli یا Swarming در پروتئوس، امکان تشخیص سریع پاتوژن‌هایی مانند کلبسیلا، سالمونلا و سودوموناس را فراهم می‌کنند. این محیط با مهار باکتری‌های گرم مثبت و تمایز بر اساس تخمیر لاکتوز، در تشخیص عفونت‌های روده‌ای، و بیمارستانی کاربرد دارد. رعایت پروتکل‌های آماده‌سازی، کشت و تفسیر، همراه با کنترل کیفیت، کارایی EMB را به حداکثر می‌رساند. با وجود محدودیت‌هایی مانند تداخل فلور نرمال، ترکیب EMB با روش‌های مولکولی و اتوماسیون، دقت تشخیص را افزایش می‌دهد. آزمایشگاهی‌ها باید با ویژگی‌های کلنی و روش‌های تفسیر آن‌ها آشنا باشند تا تشخیص دقیق و به‌موقع پاتوژن‌ها را تضمین کنند.
منابع
Bailey & Scott’s Diagnostic Microbiology
Manual of Clinical Microbiology
Koneman’s Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology
Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing
Clinical Microbiology Procedures Handbook
Jawetz, Melnick & Adelberg’s Medical Microbiology