واکنش زنجیره‌ای پلیمراز PCR (polymerase chain reaction) یک تکنیک آزمایشگاهی است که همانندسازی و تکثیر قطعه‌ای از DNA را به میلیون‌ها برابر آن امکان‌پذیر می‌سازد، بدین ترتیب موجب شناسایی سریع و اختصاصی میکروارگانیسم موجود در نمونه می‌شود. نمونه PCR می‌تواند از ناحیه‌های مختلف مانند پوست و مایعات و بزاق دهان باشد. روش  PCR علاوه بر استفاده در تشخیص‌های آزمایشگاهی، به عنوان روشی مطمئن با حساسیت و دقت بالا در زمینه پژوهش‌های علمی، تحقیقاتی و آینده‌ی درخشان پزشکی در سطح جهان مطرح است.

پارس پیوند، مشاور شما در تامین مواد مصرفی آزمایشگاه

راه های تماس با ما:

• شماره تلفن شرکت:021-40660490-5
• داخلی: 1053، 1055، 1056، 1058
• شماره های واتساپ: 09101701080, 09103146893, 09103147287, 09036641890

دایرکت اینستاگرام: @parspeyvand

مراحل انجام  PCR چگونه انجام می شود؟

PCR شامل 3 مرحله می‌باشد:

• Denaturation:  این مرحله در دمای 96 درجه سانتی گراد و به منظور دناتوره و جدا شدن دو رشته DNA از یکدیگر انجام می شود.
• Annealing: در این مرحله پرایمر در دمای 50 تا 65 درجه سانتی گراد به نواحی مکمل خود در رشته DNA متصل می شود و محدوده ای از DNA که قرار است تکثیر آن انجام شود مشخص می شود.
• Extension : این مرحله در دمای 72 درجه سانتی گراد صورت می گیرد و رشته جدید DNA توسط آنزیم Taq polymerase  ساخته می شود. اکنون چهار رشته DNA داریم.
• Final Elongation: این مرحله، پس از آخرین سیکل  PCR در دمای 72 درجه انجام می شود، تا اطمینان حاصل شود که همه تک رشته های DNA همانند سازی شده اند.
• Final hold: در این مرحله، محلول نهایی به مدت کوتاهی در دمای ۴ الی ۱۵ درجه قابل نگهداری است. در نهایت می توان صحت انجام PCR را از طریق الکتروفورز در ژل آگارز یا پلی اکریل امید بررسی نمود.

انواع تکنیک PCR:

Conventional PCR

این روش PCR سنتز قطعات خاص DNA را با استفاده از آنزیم DNA پلیمراز، که در تکثیر ماده ژنتیکی سلولی شرکت می کند، امکان پذیر می کند. آنزیم DNA پلیمراز، یک توالی مکمل از DNA را سنتز می کند، زیرا یک قطعه کوچک (پرایمر) به یکی از رشته های DNA در محل خاصی که برای شروع سنتز انتخاب شده است متصل می شود. پرایمرها توالی مورد تکرار را محدود می کنند و نتیجه تکثیر یک توالی DNA خاص با میلیاردها نسخه است.

RFLP PCR

روش RFLP PCR روشی آسان برای تعیین ژنوتیپ واریانت‌ها استفاده می شود.  RFLP PCR از روش های تشخیص جهش ها و پلی مورفیسم ها در ژنوم است.

ARMS PCR

تکنیک ARMS PCR یک روش مطمئن و سریع برای شناسایی جهش های نقطه ای و پلی مورفیسم ها و حذف های کوچک است. از این روش می توان برای جداسازی آلل های یک ژن که حتی در حد یک جفت باز هستند و هم چنین برای تعیین ژنوتیپ و جدا کردن افراد هموزیگوت و هتروزیگوت از نظر یک لوکوس ژنی از هم استفاده کرد.

Tetra ARMS PCR

در تکنیک Tetra ARMs PCR از 4 پرایمر به صورت همزمان برای یک واکنش استفاده می شود بنابراین نحوه طراحی پرایمر اهمیت زیادی دارد. طراحی پرایمر ها به گونه‌ای انجام می شود که بتوان دو واکنش PCR با پرایمر مختص الل نرمال و پرایمر مختص الل موتانت را هم زمان در یک واکنش PCR بررسی کرد.

Multiplex PCR

تکنیک Multiplex PCR نخستین بار در سال 1988 برای شناسایی جهش های dystrophin استفاده شد و امروزه برای شناسایی SNP ها و میکروستلیت ها در انگشت نگاری DNA بسیار پرکاربرد می باشد. استفاده از این تکنیک زمان، هزینه و خطر آلودگی متقاطع را کاهش می دهد، زیرا جابجایی نمونه حداقل است.

برای مطالعه چندین اگزون از یک ژن و بررسی جهش های موجود در آن ها از تکنیک Multiplex PCR استفاده می کنیم زیرا باعث صرفه جویی در زمان و هزینه می شود و روشی سریع و راحت در تشخیص پزشکی (به عنوان مثال تشخیص بیماری زایی دو سویه مختلف باکتریایی) و آزمایشات تحقیقاتی می باشد.

Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR)

RT-PCR و یا نسخه برداری معکوسی روشی است که cDNA از RNA با استفاده از آنزیم ترانسکریپتاز معکوس ساخته می شود. Taq polymerase توانایی استفاده از RNA به عنوان رشته الگو را ندارد به همین دلیل در این روش ابتدا باید سنتز cDNA صورت گیرد و سپس فرایند تکثیر انجام شود. این تکنیک برای تشخیص بسیاری از ویروس ها که دارای RNA هستند بسیار کاربردی می باشد.

RT-PCR را می توان با دو روش RT-PCR یک مرحله ای و RT-PCR دو مرحله ای انجام داد.

Nested PCR

Nested PCR حالتی از تکنیک PCR می باشد که در آن حساسیت و مقاومت واکنش با کمک دو جفت پرایمر به واسطه جلوگیری از اتصال غیر اختصاصی افزایش می‌یابد. Nested PCR روشی مناسب در مطالعات فیلوژنتیکی و تشخیص پاتوژن های مختلف می باشد. گاهی در PCR عادی پرایمر ها به طور نادرست به DNA هدف متصل شده و قطعات غیراختصاصی نسبت به پرایمر تکثیر می شود و به هر میزان که تعداد سیکل های PCR و مدت زمان Extension ثانویه بیشتر باشد احتمال اتصال نادرست افزایش می یابد، در چنین شرایطی اگر طراحی پرایمر بهتری که به درستی به توالی هدف متصل شود برای ما میسر نباشد برای افزایش حساسیت و اختصاصیت واکنش می توان از Nested PCR استفاده کرد. حتی در مواقعی که کیفیت DNA ما مناسب نیست و مقدار آن در نمونه بسیار کم است، استفاده از این تکنیک می تواند باعث افزایش تولید محصول هدف تا چندین برابر محصول تولید شده در PCR معمولی شود.

PCR اختصاصی متیلاسیون

این تکنیک در سال 1996 به وسیله Herman و همکارانش شناسایی و معرفی گردید. تکنیک MSP کاربرد گسترده در بررسی جزایر CpG پروموتر ها دارد و از دو بخش اصلی تشکیل شده است:

1- سیتوزین‌ های متیله‌ نشده در اثر سدیم بی‌سولفیت به یوراسیل تبدیل شده، در صورتی که سیتوزین‌ های متیله‌ شده تغییری نمی کنند.

2- بررسی تفاوت‌ های توالی تیمار شده با بی‌سولفیت تحت تاثیر PCR، با استفاده از پرایمرهای اختصاصی هر دو نوع DNA متیله و غیرمتیله.

اساس کار قرار دادن توالی‌ های دارای CpG تحت تاثیر سدیم بی سولفیت است که به طور قطع الل‌هایی که CpG هایشان متیله هستند نسبت به آن‌ هایی که غیرمتیله هستند، توالی متفاوتی را حاصل خواهد کرد. سپس از دو جفت پرایمر اختصاصی توالی‌ های متیله شده و متیله نشده برای ژن موردنظر استفاده می کنیم که پرایمر متیله‌ نشده (UMP)، تنها مولکول DNA ای را که در اثر سدیم بی سولفیت تغییر کرده است را تکثیر می‌ کند در حالیکه، که پرایمر متیله‌ شده (MSP)، مخصوص DNA متیله شده تغییر یافته در اثر سدیم بی سولفیت می‌باشد.

Real Time PCR

تکنیک Real Time PCR که به آن Quantitative PCR یا PCR کمی نیز گفته می شود. به طور عمده بررسی بیان ژن با real time pcr انجام می شود، هر چند که در تعیین میزان ویروس های یک نمونه هم تکنیکی قوی و حساس به شمار می آید. این تکنیک کاربردهای فراوانی دیگری همچون بررسی میزان تأثیر دارو درمانی، سنجش آسیب های DNA، تشخیص عوامل بیماری زا، تعیین ژنوتیپ افراد، سنجش تفکیک شدن آللی و … دارد.

در روش Real Time PCR از یک مولکول گزارشگر فلوروسنت برای مشاهده پیشرفت PCR استفاده می شود و قدرت سیگنال فلوئورسنت تولید شده ارتباط مستقیمی با مقدار مولکول‌ های تکثیرشده دارد. در این روش میزان محصولاتی که حین یک آزمایش PCR تولید می‌ شوند با میزان محصولات تولید شده طی آزمایش‌ های PCR با مقدار نوکلئیک ‌اسید آغازکننده مشخص، مقایسه می‌شود و امکان پی بردن به مقدار نوکلئیک اسید اولیه موجود در نمونه، فراهم می شود.