رنگ‌آمیزی زیل‌نلسون؛ کاربردها و روش انجام آن
مقدمه
رنگ‌آمیزی زیل‌نلسون (Ziehl–Neelsen staining) یکی از روش‌های مهم و کلاسیک در میکروب‌شناسی تشخیصی است که برای شناسایی باکتری‌های اسید فست به کار می‌رود. این روش نخستین بار در اواخر قرن نوزدهم توسط فرانز زیل و فریدریش نلسون معرفی شد و به عنوان استاندارد طلایی برای تشخیص مایکوباکتریوم‌ها به‌ویژه مایکوباکتریوم توبرکلوزیس شناخته می‌شود. اهمیت این روش در تشخیص سریع بیماری‌های مهلکی مانند سل (Tuberculosis) و جذام (Leprosy) بسیار بالاست، چرا که در بسیاری از موارد، نتایج کشت زمان‌بر هستند و روش‌های مولکولی نیز در دسترس همه آزمایشگاه‌ها قرار ندارند.
اصل روش زیل‌نلسون
اصل این رنگ‌آمیزی بر پایه وجود مایکولیک اسید (Mycolic acid) در دیواره سلولی باکتری‌های اسیدفست است. این ترکیبات چربی و مومی‌شکل موجب می‌شوند که سلول‌ها در برابر رنگ‌آمیزی‌های معمولی مقاوم باشند. در روش زیل‌نلسون، رنگ اولیه فوشین کربول (Carbol Fuchsin) با حرارت دادن به دیواره باکتری نفوذ می‌کند. سپس با استفاده از ماده رنگ‌بر (اسید-الکل)، تمام باکتری‌ها و سلول‌های غیر اسیدفست رنگ خود را از دست می‌دهند؛ اما باکتری‌های اسیدفست به دلیل داشتن لایه ضخیم مومی، رنگ قرمز فوشین را حفظ می‌کنند. در مرحله نهایی، رنگ متضاد (Counterstain) مانند متیلن بلو یا مالاشیت گرین استفاده می‌شود تا سایر سلول‌ها به رنگ آبی یا سبز دیده شوند.
مراحل انجام رنگ‌آمیزی زیل‌نلسون
- تهیه اسمیر نازک از نمونه (خلط، بافت یا نمونه‌های دیگر) و تثبیت آن بر روی لام.
- پوشاندن اسمیر با فوشین کربول و حرارت دادن ملایم (تا بخار ایجاد شود، بدون جوشیدن)
- شست‌وشو با آب و سپس استفاده از اسید-الکل (HCl–alcohol) برای رنگ‌زدایی.
- شست‌وشو و استفاده از رنگ متضاد (مانند متیلن بلو)
- مشاهده زیر میکروسکوپ نوری: باکتری‌های اسیدفست به رنگ قرمز-صورتی و سایر سلول‌ها به رنگ آبی دیده می‌شوند.
کاربردهای تشخیصی رنگ‌آمیزی زیل‌نلسون
- تشخیص بیماری سل (TB): مهم‌ترین کاربرد این روش، شناسایی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس در نمونه‌های بالینی به ویژه خلط بیماران مشکوک به سل ریوی است.
- تشخیص جذام: در موارد مشکوک به مایکوباکتریوم لپره نیز کاربرد دارد.
- تشخیص سایر مایکوباکتری‌های غیرسلی (NTM): این روش می‌تواند در افتراق و شناسایی سایر گونه‌های مایکوباکتریوم از باکتری‌های غیر اسیدفست کمک کند.
- افتراق باکتری‌های اسیدفست دیگر: برخی گونه‌های نوکاردیا و رودوکوکوس نیز با این روش شناسایی می‌شوند.
مزایا و محدودیت‌ها
مزیت اصلی رنگ‌آمیزی زیل‌نلسون، سادگی، سرعت و هزینه پایین آن است. این روش می‌تواند ظرف مدت چند دقیقه وجود باسیل‌های اسیدفست را نشان دهد و همچنان در بسیاری از کشورهای در حال توسعه به عنوان ابزار اصلی تشخیص سریع سل استفاده می‌شود. از طرفی، محدودیت‌های مهمی نیز وجود دارند: حساسیت این روش نسبت به روش‌های مولکولی و کشت پایین‌تر است (حداقل ۱۰⁴ باسیل در هر میلی‌لیتر لازم است تا اسمیر مثبت شود). همچنین تشخیص گونه‌های مختلف مایکوباکتریوم صرفاً بر اساس این رنگ‌آمیزی ممکن نیست و نیاز به روش‌های تکمیلی دارد.
مقایسه با سایر روش‌ها
در سال‌های اخیر، روش‌های دیگری مانند رنگ‌آمیزی فلورسانس (اورامین رودامین) معرفی شده‌اند که حساسیت بالاتری در مقایسه با زیل‌نلسون دارند. با این حال، زیل‌نلسون همچنان به دلیل سادگی، هزینه کم و عدم نیاز به تجهیزات پیچیده در بسیاری از کشورها به عنوان روش استاندارد اولیه تشخیص سل به کار می‌رود. در آزمایشگاه‌های مرجع، ترکیب این روش با روش‌های کشت و تست‌های مولکولی (PCR) باعث افزایش دقت تشخیصی می‌شود.
اهمیت آموزش و مهارت تکنسین
اجرای صحیح رنگ‌آمیزی زیل‌نلسون نیازمند دقت، مهارت و آموزش کافی تکنسین‌های آزمایشگاه است. زمان‌دهی نادرست در مراحل رنگ‌آمیزی، استفاده از معرف‌های بی‌کیفیت یا آماده‌سازی نامناسب اسمیر می‌تواند منجر به نتایج اشتباه شود. بنابراین، کنترل کیفیت در آزمایشگاه و استفاده از نمونه‌های کنترل مثبت و منفی برای پایش عملکرد روش از اهمیت بالایی برخوردار است.
نتیجه‌گیری
رنگ‌آمیزی زیل‌نلسون یکی از ابزارهای کلاسیک اما حیاتی در میکروب‌شناسی تشخیصی است که همچنان جایگاه ویژه‌ای در تشخیص سریع بیماری‌های عفونی مانند سل دارد. هرچند روش‌های جدید مانند PCR و تست‌های مولکولی حساسیت و ویژگی بالاتری ارائه می‌دهند، زیل‌نلسون به دلیل هزینه پایین، سهولت انجام و امکان کاربرد در آزمایشگاه‌های پایه، همچنان یکی از پرکاربردترین روش‌های تشخیصی در سراسر جهان است.
منابع
Ziehl–Neelsen staining: theory and practice
Acid-Fast Positive and Acid-Fast Negative Mycobacterium tuberculosis: The Koch Paradox
A cold staining method for acid-fast bacilli
Comparison of strip and Ziehl-Neelsen methods for staining acid-fast bacteria
Comparative evaluation of two cold staining methods with the Ziehl-Neelsen method for the diagnosis of tuberculosis
A modified acid-fast staining method for rapid detection of Mycobacterium tuberculosis