معرف‌های مورد استفاده در میکروبیولوژی آزمایشگاهی
مقدمه
در میکروبیولوژی آزمایشگاهی معرف‌ها (Reagents) نقش حیاتی در شناسایی، جداسازی و شناسایی نهایی میکروارگانیسم‌ها دارند. این مواد شیمیایی یا بیولوژیکی با هدف ایجاد واکنش‌های خاص با ساختارها یا متابولیت‌های میکروب‌ها استفاده می‌شوند و اطلاعات دقیقی درباره ماهیت و ویژگی‌های آن‌ها به دست می‌دهند. انتخاب و استفاده صحیح از معرف‌ها نه‌تنها دقت نتایج را تضمین می‌کند بلکه از بروز خطاهای تشخیصی جلوگیری می‌کند.
دسته‌بندی کلی معرف‌ها در میکروبیولوژی
- معرف‌های رنگ‌آمیزی (Staining Reagents)
برای مشاهده مورفولوژی میکروب‌ها زیر میکروسکوپ با ایجاد کنتراست بین سلول و زمینه استفاده می‌شوند.
الف. معرف‌های رنگ‌آمیزی گرم (Gram Stain Reagents)
- کریستال ویوله (Crystal Violet): رنگ اولیه که تمام سلول‌ها را رنگی می‌کند.
ید لوگول (Lugol’s Iodine): تثبیت‌کننده رنگ در باکتری‌های گرم مثبت.
- الکل-استون: عامل بی‌رنگ‌کننده.
- سافرانین: رنگ متقابل برای گرم منفی‌ها.
ب. رنگ‌آمیزی اسیدفست (Ziehl-Neelsen): کربول فوشین، اسید الکل، متیلن بلو.
ج. رنگ‌آمیزی اندوسپور: مالاشیت گرین و سافرانین.
د. رنگ‌های فلورسنت: اورامین رودامین برای مایکوباکتریوم، آکریدین اورنج برای DNA/RNA
معرف‌های شیمیایی برای تست‌های بیوشیمیایی (Biochemical Test Reagents)
این گروه برای شناسایی متابولیک باکتری‌ها بر اساس واکنش‌های آنزیمی یا تولید متابولیت‌ها استفاده می‌شود.
- تست کاتالاز: محلول %3 یا %30 پراکسید هیدروژن (H₂O₂)
- تست اکسیداز: معرف تترا‌متیل-p-فنیلن‌دی‌آمین دی‌هیدروکلراید.
- تست ایندول: معرف کوواکس (Kovac’s) یا ارلیخ (Ehrlich’s) حاوی پارادی‌متیل‌آمینوبنزالدهید و اسید کلریدریک
- تست MR-VP: معرف متیل رد برای تشخیص تولید اسید پایدار در MR و معرف α-نفتول و محلول KOH %40 برای تشخیص استوئین در VP.
- تست سیترات: معرف بروموتیمول بلو به‌عنوان نشانگر pH
- تست اوره‌آز: فنل رد به‌عنوان اندیکاتور Ph
- تست H₂S در TSI و LIA: نمک آهن فرو یا FeCl₃ به‌عنوان شناساگر سولفید هیدروژن.
معرف‌های سرولوژیک (Serological Reagents)
برای شناسایی آنتی‌ژن‌ها یا آنتی‌بادی‌های اختصاصی میکروبی استفاده می‌شوند.
- آگلوتیناسیون اسلایدی: سرم‌های پلی‌والان و مونووالان برای سالمونلا، شیگلا، ویبریو.
- لاتکس آگلوتیناسیون: ذرات لاتکس پوشیده‌شده با آنتی‌بادی علیه مننگوکوک، استرپتوکوک گروه B و A
- فلورسنت آنتی‌بادی: FITC-labeled antibodies برای تشخیص مستقیم.
معرف‌های شناسایی توکسین‌ها و متابولیت‌ها
- تست الک (Eleck’s Test) برای دیفتری توکسین.
- معرف نیترات برای تست نیترات ردوکتاز (سولفانیلیک اسید + α-نفتیل‌آمین)
معرف‌های اختصاصی برای قارچ‌شناسی (Mycology Reagents)
- KOH %10-20: حل‌کننده کراتین برای مشاهده قارچ‌ها در نمونه‌های پوستی و ناخن.
- لاکتوفنل کاتن بلو: رنگ‌آمیزی ساختار قارچی.
- آنتی‌سرم‌های اختصاصی کاندیدا یا کریپتوکوکوس.
- در شناسایی قارچ‌ها، معرف‌هایی مانند کاتون بلو (Cotton Blue) برای مشاهده ساختار هیف و کنیدیا، و Calcofluor White برای رنگ‌آمیزی دیواره سلولی قارچ‌ها به کار می‌روند. کلکوفلور وایت به کیتین و سلولز متصل شده و تحت نور UV فلورسنس آبی از خود نشان می‌دهد، که برای تشخیص سریع عفونت‌های قارچی در نمونه‌های بافتی و خلط کاربرد فراوان دارد.
معرف‌های پارازیتولوژی (Parasitology Reagents)
- لوگول: مشاهده ساختار کیست آمیب.
- محلول نمکی اشباع و محلول فرمالین-اتر: برای تغلیظ انگل‌ها.
رنگ رایت و گیمسا: برای رنگ‌آمیزی انگل‌های خونی.
معرف‌های آماده و تجاری
- API strips و kitهای تشخیصی: حاوی محیط‌ها و معرف‌های خشک‌شده برای شناسایی سریع.
- قرص‌های شیمیایی (Oxoid Discs): برای تست آنزیم‌ها یا متابولیت‌ها.
معرف‌های فلورسنت (Fluorescent Dyes)
در میکروبیولوژی مدرن، استفاده از رنگ‌های فلورسنت مانند آکریدین اورنج، فلورسین ایزوتیوسینات (FITC) و DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) برای شناسایی سریع باکتری‌ها و ویروس‌ها در نمونه‌های بالینی رواج دارد. این رنگ‌ها با اتصال اختصاصی به اسیدهای نوکلئیک یا ساختارهای پروتئینی، امکان تصویربرداری با میکروسکوپ فلورسنت یا لیزری را فراهم می‌کنند. به عنوان مثال، DAPI به DNA متصل شده و نور آبی ساطع می‌کند، که در تشخیص عفونت‌های ناشی از کلامیدیا یا مایکوپلاسما بسیار کاربردی است.
معرف‌های کروموژنیک و سوبستراهای آنزیمی
در محیط‌های کشت کروموژنیک، از معرف‌هایی مانند X-Gal، ONPG (Ortho-Nitrophenyl-β-galactopyranoside) و X-Gluc استفاده می‌شود. این ترکیبات به وسیله آنزیم‌های خاص باکتریایی شکسته شده و محصول رنگی مشخصی تولید می‌کنند. این ویژگی در تشخیص افتراقی گونه‌ها، به‌ویژه در تست‌های شناسایی E. coli و گونه‌های سالمونلا بسیار مهم است. این محیط‌ها به دلیل وضوح نتایج، در کشت‌های بالینی و کنترل کیفیت صنایع غذایی کاربرد گسترده دارند.
معرف‌های شناسایی متابولیت‌های خاص
برخی معرف‌ها برای شناسایی مولکول‌های متابولیکی خاص طراحی شده‌اند. به عنوان نمونه، معرف نیسین برای سنجش فعالیت ضدباکتریایی لاکتوباسیل‌ها در صنایع لبنی، یا معرف TTC برای بررسی فعالیت تنفسی میکروارگانیسم‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرد. معرف TTC در حضور میکروارگانیسم‌های فعال به رنگ قرمز در می‌آید و میزان متابولیسم سلولی را نشان می‌دهد.
معرف‌های سنجش مقاومت آنتی‌بیوتیکی
در تست‌های تعیین حساسیت میکروبی، علاوه بر دیسک‌های آنتی‌بیوتیکی، از معرف‌هایی مانند رزازورین (Resazurin) و آلیزارین رد (Alizarin Red) استفاده می‌شود. این معرف‌ها با تغییر رنگ در اثر رشد یا توقف رشد باکتری‌ها، امکان سنجش سریع مقاومت دارویی را فراهم می‌کنند. این روش به‌ویژه در Microdilution assays و E-test کاربرد دارد.
ملاحظات ایمنی و نگهداری
معرف‌ها باید طبق MSDS هر ماده نگهداری شوند. دما، نور و رطوبت بر پایداری اثر دارند (مثلاً رنگ‌های فلورسنت باید در دمای پایین و در تاریکی نگهداری شوند). تاریخ انقضا و تغییر رنگ یا رسوب نشانه فساد معرف است. برخی معرف‌ها مانند فنل، اسیدها و فرمالدهید سمی و خورنده‌اند و باید با دستکش و عینک کار شوند.
نتیجه‌گیری
معرف‌ها ابزارهای کلیدی در میکروبیولوژی هستند که بدون آن‌ها شناسایی دقیق میکروارگانیسم‌ها امکان‌پذیر نیست. تسلط بر نوع، عملکرد و شرایط استفاده از هر معرف برای تکنولوژیست آزمایشگاه ضروری است. آشنایی با تازه‌ترین معرف‌های تجاری و رعایت نکات ایمنی نیز کیفیت و دقت کار آزمایشگاهی را به‌طور چشمگیری افزایش می‌دهد.
منابع
Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses
Preparation and use of cellular reagents: a low-resource molecular
Microbiology in Clinical Pathology
Reagents, stains, and media: Bacteriology
Production of Basic Diagnostic Laboratory Reagents