چاکلت آگار چیست و چرا برای رشد هموفیلوس و نایسریا ضروری است؟
مقدمه
چاکلت آگار (Chocolate Agar) یا آگار شکلاتی یکی از محیط‌های کشت غنی‌سازی شده غیرانتخابی در میکروبیولوژی بالینی است. این محیط از رشد باکتری‌های سریع‌الرشد جلوگیری نمی‌کند و برای جداسازی باکتری‌های سخت رشد مانند هموفیلوس آنفلوانزا و نایسریا مننژیتیدیس ضروری است .در این مقاله، ساختار، مکانیسم تغذیه‌ای، موارد استفاده و اهمیت چاکلت آگار در تشخیص عفونت‌های تنفسی و مننژیتی بررسی خواهد شد.
ترکیب و اصول آماده‌سازی
پایه آگار خون معمول است و سپس با گرما (حدود 75–80 °C) RBCها لیز (lysis) می‌شوند که به رنگ قهوه‌ای تیره می‌انجامد. این فرآیند هم هموگلوبین (عامل X یا هِمین) و هم NAD+ (عامل V) را آزاد می‌کند؛ دو عاملی که بسیاری از باکتری‌های سخت رشد برای رشد به آن‌ها وابسته‌اند .
فرمول تجاری شامل دیپپپتون/کازئین، نشاسته ذرت، بافر فسفات، کلرید سدیم، آگار، محلول هموگلوبین و افزودنی‌هایی مثل Isovitox یا مکمل‌های هموآنزیمی است.
- آماده‌سازی پایه آگار:
مواد لازم برای ۱ لیتر محیط پایه: پپتون 10 گرم، عصاره مخمر2 گرم، کلرید سدیم 5گرم گرم، آگار 15 گرم، آب مقطر ۱۰۰۰ میلی‌لیتر
همه مواد بالا را در آب مقطر حل کرده و با حرارت دادن (در بن‌ماری یا هیتر مغناطیسی) کاملاً مخلوط کنید تا آگار ذوب شود.
- تنظیم pH و استریلیزاسیون: با استفاده از pH متر، pH محیط را به حدود 2/7 تا 4/7 تنظیم کنید. محلول را در اتوکلاو در دمای ۱۲۱ درجه سانتی‌گراد به مدت ۱۵ دقیقه استریل کنید.
- ذوب و خنک‌سازی محیط پایه:
پس از خارج کردن از اتوکلاو، محیط را تا دمای ۷۵–۸۰ درجه سانتی‌گراد خنک کنید (نه بیشتر، نه کمتر)؛ چون در این دما هم باکتری‌ها کشته می‌شوند، هم RBC لیز می‌شود، بدون اینکه فاکتورهای رشد حیاتی از بین بروند.
- اضافه کردن خون گوسفندی:
۵ تا ۱۰ درصد خون گوسفندی تازه (با ضدانعقاد مانند سیترات یا هپارین) را به محیط خنک‌شده (۷۵-۸۰ درجه) بیفزایید. با همزن مغناطیسی یا به آرامی با تکان دادن، محیط را هم بزنید تا رنگ قهوه‌ای شکلاتی یکنواختی ایجاد شود. این رنگ ناشی از لیز شدن گلبول‌های قرمز و آزاد شدن فاکتورهای X و V است.
- ریختن در پتری دیش:
محیط تهیه‌شده را در شرایط استریل در پتری‌دیش‌های استریل بریزید (حدود ۲۰ میلی‌لیتر برای هر پلیت). بگذارید محیط در دمای اتاق ببندد و جامد شود (حدود ۱۵–۳۰ دقیقه(.
- نگهداری محیط:
پلیت‌های آماده را در کیسه‌های پلاستیکی درب‌دار یا محفظه استریل نگهداری کنید.
دمای نگهداری: ۲ تا ۸ درجه سانتی‌گراد
مدت نگهداری: حداکثر ۲ هفته
- کنترل کیفیت (QC):
قبل از استفاده، بهتر است محیط را با کشت باکتری‌های مرجع مانند هموفیلوس آنفلوانزا یا نایسریا گونوره بررسی کنید تا از عملکرد صحیح آن مطمئن شوید.
مکانیسم بیوشیمیایی و تغذیه باکتری
هموفیلوس آنفلوانزا برای رشد نیازمند هِمین و NAD+ است؛ NAD در محیط خون معمول آزاد است اما هِمین تنها پس از لیز RBC قابل دسترسی می‌شود. همین فرایند برای نایسریا نیز ضروری است زیرا این باکتری‌ها نیز به فاکتورهای رشد مخصوص نیاز دارند. گرما همچنین آنزیم‌های باکتریالی مانند NADase را فعال می‌کند که این عوامل را از توزیع یکنواخت محافظت می‌نماید .
ویژگی‌های کلنی
- هموفیلوس آنفلوانزا: کلونی‌های کوچک، ترنسپارنت یا خاکستری با بوی متمایز.
- نایسریا گونوره: کلنی‌های کوچک، خاکستری روشن؛
- نایسریا مننژیتیدیس: کلنی‌های بزرگ‌تر، خاکستری مایل به آبی.
کلنی‌های غیرهموفیلوس/نایسریا نیز رشد می‌یابند؛ بنابراین گاهی لازم است از نسخه انتخابی مانند Thayer-Martin استفاده شود .
کاربردهای بالینی
- تشخیص عفونت‌های تنفسی و مننژیت:
هموفیلوس آنفلوانزا و نایسریا مننژیتیدیس در نمونه‌های سرفه، خلط، CSF یا اسپوتوم قابل رشد‌اند و چاکلت آگار به عنوان محیط اولیه کشت توصیه می‌شود .
- فرایند آماده‌سازی ساده و سریع آن امکان استفاده وسیع در آزمایشگاه‌های بالینی دارد. افزون بر این، نسخه‌هایی با کتون انتخابی مانند افزودن باسیتراسین مخصوص همه‌ی گونه‌ها نیستند و می‌توانند کلنی‌هایی از انواع هموفیلوس را جداسازی کنند .
نقش چاکلت آگار در شرایط اپیدمیولوژیک و بحران‌های سلامت عمومی
در شرایط همه‌گیری‌های مننژیت یا شیوع عفونت‌های شدید تنفسی، آزمایشگاه‌های بالینی نیازمند محیط کشت قابل اطمینان و سریع‌العمل هستند. چاکلت آگار به دلیل توانایی در جداسازی سریع نایسریا مننژیتیدیس از نمونه‌های CSF و خون، یکی از ابزارهای اصلی غربالگری در این شرایط محسوب می‌شود. به‌ویژه در مناطق با دسترسی محدود به تکنیک‌های مولکولی، این محیط می‌تواند به‌صورت جایگزین مناسب عمل کرده و به تصمیم‌گیری درمانی سریع کمک کند. همچنین در زمان پاندمی‌ها، مانند کووید-۱۹ که عفونت‌های ثانویه باکتریایی افزایش می‌یابد، استفاده از محیط‌هایی مانند چاکلت آگار برای شناسایی عفونت‌های همراه اهمیت بیشتری می‌یابد.
مقایسه با سایر محیط‌های کشت مشابه
در مقایسه با محیط خوندار بلاد آگار، چاکلت آگار قادر است میکروارگانیسم‌هایی را که نیاز به فاکتورهای رشد خاص دارند، بهتر تغذیه و تکثیر دهد. برخلاف بلاد آگار، در چاکلت آگار هیچ نوع همولیز واضحی دیده نمی‌شود، زیرا سلول‌های خونی قبلاً لیز شده‌اند. همچنین در مقابل محیط‌هایی مانند تایر مارتین آگار که انتخابی هستند و با آنتی‌بیوتیک‌های خاص رشد فلور نرمال را مهار می‌کنند، چاکلت آگار یک محیط غیرانتخابی است. این ویژگی آن را برای استفاده‌های اولیه تشخیصی مناسب می‌سازد، اگرچه برای تأیید نوع باکتری، معمولاً محیط انتخابی در مرحله بعدی پیشنهاد می‌شود.
نکات فنی برای استفاده در آزمایشگاه
برای دستیابی به بهترین نتیجه، توصیه می‌شود چاکلت آگار در شرایط CO₂ ۵ تا 10 % انکوبه شود، به‌ویژه هنگام کشت نایسریا یا هموفیلوس دمای انکوباسیون باید حدود ۳۵ تا ۳۷ درجه سانتی‌گراد باشد و مدت زمان رشد معمول بین ۱۸ تا ۴۸ ساعت است. استفاده از نمونه‌های تازه و حمل سریع آن‌ها به محیط کشت نیز در افزایش دقت نتایج اهمیت دارد. همچنین لازم است محیط‌های چاکلت آگار از نظر آلودگی، تغییر رنگ یا خشک شدن پیش از استفاده بررسی شوند، زیرا این عوامل می‌توانند رشد باکتری را مختل کنند یا نتایج اشتباه ایجاد نمایند.
محدودیت‌ها
- این محیط انتخابی نیست؛ انواع ناپاتوژن‌ها می‌توانند رشد کنند و باعث overgrowth شوند.
- نه برای بررسی همولیز مناسب است و نه برای باکتری‌هایی که عوامل X/V را ندارند.
- نیاز به شرایط انکوباسیون با CO₂ 5 تا 10٪ برای رشد مطلوب
نتیجه‌گیری
چاکلت آگار یک محیط غنی‌شده ضروری برای جداسازی و کشت باکتری‌های سخت رشد، به‌ویژه هموفیلوس آنفلوانزا و نایسریا است. با استفاده از لیز RBC و آزادسازی عوامل رشد حیاتی، این محیط امکان تشخیص سریع عفونت‌های حاد تنفسی و مننژیت را فراهم می‌کند. البته استفاده از محیط‌های انتخابی برای تفکیک دقیق گونه‌ها ضروری است. پاسخی به نیازهای پزشکان و زیست‌شناسان در زمینه مراقبت بالینی محسوب می‌شود و ابزار مهمی برای تشخیص صحیح در آزمایشگاه‌های میکروبیولوژی بالینی است.
منابع
Chocolate agar: Composition, Principle, Preparation, Results, Uses
Great Adventures in the Microbiology Laboratory
Haemophilus species culture requirements
Chocolate Agar with Bacitracin formulation
Neisseria meningitidis diagnosis protocols