مانیتول سالت آگار (MSA): محیط کشتی تخصصی برای شناسایی استافیلوکوکوس اورئوس
مقدمه
در دنیای میکروبیولوژی بالینی، محیط‌های کشت انتخابی و افتراقی نقش کلیدی در شناسایی اولیه و جداسازی دقیق باکتری‌ها دارند. مانیتول سالت آگار (MSA) یکی از پرکاربردترین محیط‌های کشت افتراقی-انتخابی است که برای جداسازی گونه‌های مختلف استافیلوکوک به‌ویژه استافیلوکوکوس اورئوس طراحی شده است. این محیط علاوه بر ایجاد شرایطی که تنها باکتری‌های خاصی در آن رشد کنند (خاصیت انتخابی)، توانایی افتراق گونه‌ها بر اساس متابولیسم مانیتول را نیز دارد. همین ویژگی‌ها، MSA را به ابزار مهمی در غربالگری باکتری‌های گرم مثبت کوکسی در کلینیک‌های عفونی، آزمایشگاه‌های مواد غذایی، بهداشتی و بیمارستانی تبدیل کرده است.
تعریف محیط MSA
مانیتول سالت آگار محیطی انتخابی و افتراقی است که به دلیل غلظت بالای نمک و وجود قند مانیتول، تنها به برخی باکتری‌های نمک‌دوست اجازه رشد می‌دهد و هم‌زمان توانایی تفکیک استافیلوکوکوس اورئوس از سایر استافیلوکوک‌ها را فراهم می‌کند.
اجزا و ترکیبات محیط MSA
برای تهیه یک لیتر مانیتول سالت آگار، اجزای زیر لازم است:
- مانیتول به مقدار ۱۰ گرم: این قند الکلی به‌عنوان منبع کربن در محیط عمل می‌کند و تخمیر آن توسط برخی باکتری‌ها باعث تولید اسید می‌شود.
- سدیم کلرید (NaCl) به میزان ۷۵ گرم: نقش مهمی در ویژگی انتخابی محیط دارد. این غلظت بالا تنها به باکتری‌های هالوتولرانت مانند استافیلوکوک‌ها اجازه رشد می‌دهد و بیشتر باکتری‌های دیگر را مهار می‌کند.
- پپتون و عصاره گوشت در مجموع حدود ۱۰ گرم: این مواد منبع نیتروژن، ویتامین‌ها و عوامل رشد هستند.
- فنل رد (Phenol Red) به میزان ۲۵ میلی‌گرم: معرف pH که در محیط‌های خنثی یا قلیایی قرمز رنگ است، اما در حضور اسید به رنگ زرد در می‌آید.
- آگار به مقدار ۱۵ گرم: عامل ژل‌کننده که محیط را به شکل جامد درمی‌آورد.
- آب مقطر به میزان یک لیتر: به‌عنوان حلال استفاده می‌شود.
پس از ترکیب این مواد، pH محیط باید در محدوده 4/7 ± 2 تنظیم شود.
نحوه تهیه MSA در آزمایشگاه
- اجزای خشک را وزن کرده و در آب مقطر بریزید.
- محلول را حرارت دهید تا کاملاً حل شود.
- pH را تنظیم کرده (در صورت نیاز) به حدود 4/7
- محلول را در شیشه‌های درب‌دار یا ارلن بریزید.
- در دمای ۱۲۱ درجه سانتی‌گراد به مدت ۱۵ دقیقه اتوکلاو کنید.
- پس از سرد شدن تا حدود ۵۰–۵۵ درجه، در پلیت‌های استریل بریزید و اجازه دهید تا جامد شود.
- در یخچال ۲–۸ درجه نگهداری شود و تا ۴ هفته قابل مصرف است.
مکانیسم عملکرد MSA
ویژگی انتخابی (Selective): غلظت بالای نمک NaCl باعث مهار رشد بیشتر باکتری‌ها، به‌ویژه باکتری‌های گرم منفی می‌شود. تنها برخی گونه‌های هالوفیل مثل استافیلوکوکوس‌ها قادر به تحمل و رشد در این محیط‌اند.
ویژگی افتراقی (Differential): قند مانیتول توسط برخی باکتری‌ها تخمیر می‌شود که منجر به تولید اسید می‌گردد. اسیدی شدن محیط باعث تغییر رنگ فنل رد از قرمز به زرد می‌شود. بنابراین:
- اگر باکتری قادر به تخمیر مانیتول باشد درنتیجه ناحیه زرد رنگ
- اگر غیرقابل تخمیر باشد درنتیجه محیط همان رنگ قرمز باقی می‌ماند
شکل کلونی‌ها و تفکیک باکتری‌ها
- استافیلوکوکس اورئوس:
- رشد قوی
- رنگ کلونی: زرد طلایی یا کرم
- رنگ زمینه محیط: زرد (مانیتول تخمیر شده) به علت تولید اسید و افت pH
- استافیلوکوکس اپیدرمیدیس:
- رشد دارد
- رنگ کلونی: سفید تا خاکستری
- رنگ زمینه: قرمز (مانیتول تخمیر نشده) به علت عدم اسیدی شدن محیط
- استافیلوکوکس ساپروفیتیکوس:
- رشد دارد
- برخی سویه‌ها مانیتول مثبت و برخی منفی هستند (نتایج متغیر)
- باکتری‌های غیر استافیلوکوکی:
- در بیشتر موارد رشد نمی‌کنند
- اگر رشد کنند، فاقد ویژگی تخمیر مانیتول هستند برای مثال E. coli، سودوموناس و استرپتوکوکوس.
کاربردهای بالینی و تحقیقاتی
- شناسایی اولیه استافیلوکوکس اورئوس در نمونه‌های بالینی (زخم، پوست، بینی، گلو)
- تمایز استافیلوکوک‌های تخمیرکننده مانیتول از دیگران
- غربالگری ناقلان بینی یا پوستی در محیط‌های بیمارستانی
- کنترل کیفیت در صنایع غذایی (آلودگی دست یا سطوح)
- مطالعات آموزشی و تحقیقاتی بر روی ویژگی‌های فیزیولوژیک باکتری‌ها
مزایا
- افتراق سریع و آسان استافیلوکوکوس اورئوس از سایر گونه‌ها
- مهار رشد باکتری‌های غیرهدف
- قابل استفاده در غربالگری‌های گسترده
- هزینه مناسب و تهیه آسان
معایب
- برخی استافیلوکوک‌های غیر اورئوس نیز ممکن است مانیتول را تخمیر کنند
- برخی سویه‌های استافیلوکوکوس اورئوس ممکن است فاقد تخمیر مانیتول باشند
- حساسیت محیط به pH و شرایط انکوباسیون
- امکان نتایج مثبت یا منفی کاذب
نکات آزمایشگاهی مهم
کشت باید در شرایط استریل و دمای ۳۵–۳۷ درجه سانتی‌گراد به مدت ۱۸–۴۸ ساعت انجام شود.
برای تفسیر نهایی نتیجه باید از تست‌های مکمل (کاتالاز، کوآگولاز، API Staph) استفاده شود.
در صورت نگهداری محیط آماده بیش از ۴ هفته، کارایی کاهش می‌یابد.
نتیجه‌گیری
مانیتول سالت آگار یکی از مؤثرترین محیط‌های افتراقی-انتخابی برای شناسایی اولیه استافیلوکوکوس اورئوس در نمونه‌های بالینی و محیطی است. استفاده صحیح از این محیط، همراه با آزمون‌های تکمیلی، می‌تواند کمک شایانی به کاهش خطاهای تشخیص و غربالگری دقیق بیماران یا ناقلان عفونت‌ها نماید. برای کار در محیط‌های بالینی و آموزشی، درک دقیق از عملکرد، ویژگی‌ها و محدودیت‌های این محیط، حیاتی و ضروری است.
منابع
Bailey & Scott’s Diagnostic Microbiology
Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology
Media for Isolation, Identification and Maintenance of Medical Bacteria
Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) Guidelines M100
Selective media in bacteriology
Evaluation of MSA for detection of S. aureus