پارالآب (پارافین جامد کیلویی)

آزمایش پاتولوژی

تمام مراحل کاری از ابتدای پذیرش نمونه درآزمایشگاه پاتولوژی تا آماده سازی لام و بررسی آن در زیر میکروسکوپ به عنوان روش های تکنیکی آسیب شناسی در نظر گرفته می‌شود که شامل هفت مرحله جداگانه است:‏
‏۱) فیکساسیون
۲) نمونه برداری یا پاس دادن
۴) آبگیری و آغشتگی
۴) قالب‌گیری
‏۵) برش با میکروتوم
۶) رنگ‌آمیزی
‏۷) مونتاژ لام و لامل

1) فیکساسیون‎(fixation)‎‏

این مرحله صرفا”جهت حفظ ساختمان فیزیکی بافت و برای جلوگیری از اتولیز ‏‎(Autolysis)‎‏ آن انجام می‌شود. نمونه جراحی شده باید بلافاصله درون ماده فیکساتیو قرار بگیرد. برای این کار باید نوع بافت، درجه حرارت دوران پروسه، زمان فیکساسیون و ‏PH‏ محلول های به‌کار برده شده را در نظر داشت.

2) نمونه برداری یا پاس دادن

برای اجرای این مرحله، نمونه باید از لحاظ اندازه کاملا” مناسب باشد. چنانچه نمونه بزرگتر از حد معمول باشد مواد آبگیر مانند گزیلول، الکل و … نمی‌تواند در آن نفوذ کند و چنانچه خیلی کوچک باشد تهیه نمونه و به دنبال آن برش و تهیه لام و… مشکل خواهد شد. 

3) آبگیری و آغشتگی

 این کار توسط دستگاهی به نام تیشو پروسسور (‏Tissue Processor‏) انجام می‌شود که شامل  دوازده ظرف حاوی محلول های مختلف است.

این محلول‌ها 3 وظیفه بر عهده دارد: ‏

الف) آبگیری  ب) شفاف کردن   ج) آغشتگی با پارافین
حجم کلی هر ظرف  1000میلی لیتر است و ترتیب آن ها بدین صورت است:
ظروف شماره 1 و 2 حاوی فرمالین 10% است. نمونه برش داده شده حدود 3 ساعت در فرمالین قرار می‌گیرد. (چنانچه این زمان بیشتر باشد اشکالی ایجاد نمی‌کند). در بعضی موارد، در ظرف شماره 2 به جای فرمالین از آب مقطر استفاده می‌شود. مدت زمان قرار گرفتن نمونه در آب مقطر یک ساعت است. ‏
ظرف‌های سوم تا ششم شامل الکل (متانول) است، ظرف شماره  3 الکل 70%و ظرف شماره 4 الکل 80%، ظرف شماره 5 الکل 90% و ظرف شماره 6 الکل 96% است. علت صعودی انتخاب کردن این الکل‌ها این است که آب‌گیری به آرامی انجام شود.

زمان قرار گرفتن نمونه در هر کدام از این الکل‌ها یک ساعت است. به طور کلی اتانول بهتر از متانول آبگیری می‌کند ولی به علت هزینه بالاتر، از متانول استفاده می‌شود. در عین حال متانول خاصیت رنگبری هم دارد. این مرحله بسیار مهم است و چنانچه آبگیری با الکل به خوبی انجام نشود مراحل بعدی نیز  دچار اشکال شده وسبب چروکیدگی بافت‌ها خواهد گردید. ‏

ظروف شماره‌های 7 و 8 حاوی الکل متانول مطلق 100% استکه در مجموع 4ساعت آب‌گیری آنها به طول می‌انجامد.  ظروف 9 و10 گزیلول است که وظیفه شفاف‌سازی بافت و خارج کردن الکل از آن را به عهده دارد.‏
ظروف شماره 11و12 حاوی پارافین است. پارافین در دمای آزمایشگاه جامد است و باید به دمای ذوب ( 60 درجه سانتی گراد)، برسد . برای همین منظور دو ظرف آخر دارای المنتی است که باعث تولید حرارت در ظرف و ذوب شدن پارافین می‌شود. بعد از اینکه نمونه داخل  پارافین مذاب قرار گرفت. این ماده داخل بافت نفوذ کرده و بافت به حالت آغشتگی می‌رسد.

پارافین در شکاف و درز بافت نفوذ می‌کند و در دمای آزمایشگاه بافت سفت و سخت شده و قابل برش با میکروتوم خواهد شد. لازم به ذکر است که ماده آغشتگی با ماده قالب‌گیری باید یکی باشد.‏
دستگاه تیشو پروسسور مجهز به دکمه‌های خودکار تنظیم زمان (‏Timer‏)، دکمه‌های روشن و خاموش و بالا و پائین و چرخشی و چراغ‌هایی برای اطمینان از روشن بودن دستگاه و همچینین دکمه‌های تنظیم برنامه و تعیین سیکل دستگاه است تا معمولا” حدود 18 ساعت طول می‌کشد که یک سیکل کامل شود. در شکل شماره (2) دستگاه تیشوپروسسور مشاهده می‌شود.‏

4) قالب‌گیری

 برای قالب‌گیری باید ماده آغشتگی (پارافین) را در دمای 60 درجه سانتی گراد داخل فور ذوب کرده و مقداری موم به نسبت 1 به 10 به آن اضافه کرد. از موم برای قالب‌گیری محکم استفاده می‌شود. در صورتیکه فقط از پارافین استفاده شود قالب‌ها بسیار شکننده خواهند شد.

پس از این مرحله کار روی نمونه‌ها وارد مسیر جدیدی می‌شود که شامل قالب‌گیری، برش و رنگ‌آمیزی و در نهایت مونتاژ لام و لامل است. برای قالب‌گیری باید نمونه‌های آبگیری شده را به وسیله پنست داخل ظرف مخصوص قالب‌گیری قرار داده، روی آن محلول موم و پارافین ریخت و بعد از گذشت چند دقیقه شماره نمونه‌ها را روی آن‌ها قرار داد. این عمل در اصطلاح کوله کردن نمونه‌ها  نامیده می‌شود و نیاز به دقت کافی دارد. برای کامل‌تر شدن این مرحله قالب‌ها تا شروع زمان برش داخل یخچال قرار می‌گیرد. ‏

5) برش با میکروتوم

 برای شروع این مرحله به چند دستگاه جداگانه نیاز است که این دستگاه‌ها و وسایل شامل: میکروتوم، تیشوفلوت، چراغ مطالعه و قلم الماس است.‏
1) میکروتوم: دستگاهی است که از آن برای تهیه برش های نازک از  بافتی که به صورت بلوک در آمده، استفاده می‌کنند. این دستگاه دارای توانایی برش بافت در ضخامت‌های گوناگون است و آن را به دو بخش بیرونی و درونی تقسیم می‌کنند. در بخش درونی دستگاه، چرخ دنده‌های مختلفی تعبیه شده است که به وسیله دسته میکروتوم به چرخش در می‌آید و میله تنظیم میکرومتر، درجه تنظیمی را به داخل منتقل می‌کند.

با چرخش دسته می‌توان برش هایی به ضخامت 1 تا 30 میکرون و حتی بالاتر تهیه کرد. قسمت بیرونی دستگاه شامل دسته، گیره بلوک، پیچ تنظیم زاویه بلوک، جای نگهدارنده چاقوی میکروتوم، پیچ تنظیم کننده زاویه تیغ میکروتوم، درجه میکرومتر و پیچ یا دسته جلوبرنده چاقو به وسیله دست است. بر روی دسته، میله‌ای تعبیه شده که به‌وسیله آن می‌توان دسته را قفل نموده تا کاملا ثابت شود و بدین‌وسیله احتمال آسیب به دست یا خراب شدن بلوک کم می‌شود.

6) رنگ‌آمیزی بافت‌ها

این مرحله  شامل دو نوع روتین و اختصاصی است:
رنگ‌آمیزی روتین: روش رنگ‌آمیزی که در آزمایشگاه‌های پاتولوژی به طور معمول و روتین استفاده می‌شود، روش هماتوکسیلین- ائوزین است. با این روش هسته سلول رنگ بنفش و سیتوپلاسم رنگ صورتی به خود می‌گیرد.
دراین رنگ‌آمیزی، ابتدا 3 حمام گزیلول موجود است که برای شفاف سازی و از بین بردن پارافین باقی مانده در اطراف بافت‌ها استفاده می‌شود. نمونه‌ها در هر ظرف گزیلول  به مدت 5 دقیقه قرار داده می‌شود. بعد از گزیلول 4 ظرف الکل درجه بندی شده قرار دارد.

نمونه‌ها را در هر کدام به مدت 2-1 دقیقه گذاشته و بعد با آب شستشو داده می‌شود و بعد  بلافاصله  در ظرف حاوی هماتوکسیلین قرار می‌گیرد. زمان قرار گرفتن در هماتوکسیلین 15-10 دقیقه است که این زمان بستگی به تازه یا کهنه بودن رنگ دارد. لازم است بعد از این مرحله نمونه‌ها با آب شستشو داده شده و بافت های اضافی اطراف آنها پاک شود.

شستن لام

بعد از تمیز کردن لام‌ها، آن‌ها را داخل اسید الکل شناور کرده تا رنگ های اضافی داخل بافت از بین برود. بعد از اسید الکل نوبت به کربنات کلسیم می‌رسد. وظیفه این محلول، رنگ‌آمیزی زمینه بافت است و باعث می‌شود هسته آبی به نظر برسد. ظرف بعدی ائوزین است که باعث قرمز شدن سیتوپلاسم می‌گردد. بعد از چند ثانیه که نمونه ‌ها داخل ائوزین قرار گرفت آن‌ها را با آب شستشو داده، بعد به ترتیب داخل 4 ظرف الکل قرار می‌گیرد.

این الکل‌ها هم درجه بندی شده و به ترتیب 70-80-90 و 96درجه است و بافت‌ها در هر کدام،   حدود 5-3 ثانیه قرار می‌گیرد. 2 ظرف آخر شامل گزیلول است که برای شفاف تر شدن بافت‌ها استفاده می‌شود. زمان قرارگیری نمونه‌ها درگزیلول در حدود 5-3دقیقه است.‏

‏7) مونتاژ لام و لامل

برای این کارابتدا لازم است پشت لام‌ها را خشک کرده و بعد لاملی را که قبلا” روی آن یک تا د و قطره چسب مخصوص ریخته شده، با پنس روی لام قرار داد. بعد اطراف لام را کاملا” تمیز کرده و اجازه داد تا در دمای آزمایشگاه خشک شود. در آخر شماره نمونه‌ها روی برچسب نوشته شده و با دقت روی لام‌ها چسبانده می‌شود. سپس  لام‌ها همراه‎ ‎با‎ ‎برگه در خواست آنها در اختیار پاتولوژیست برای تشخیص نهایی قرار گیرد.