کیت G6PD

نقد و بررسی

آزمایش G6PD به تست حساسیت (فاویسم) می گویند. G6PD آنزیم مسیر سوخت و ساز گلوکز می باشد. اگر این آنزیم به اندازه کافی در خون وجود موجود نباشد، هموگلوبین رسوب کرده و غشای گلبول قرمز تغییر پیدا می کنند. با بروز این تغییر در غشای خونی و رسوب هموگلوبین بیماری همولیز بوجود می‌آید.

همولیز در افراد درجات متفاوتی دارد. البته این بیماری وابسته به جنسیت نیز می باشد و همراه با کروموزوم X جابجا و انتقال پیدا می کند. به همین دلیل این بیماری بیشتر در مردان دیده می شود.

چرا مردان بیشتر در معرض ابتلا به فاویسم هستند؟

مردان فقط یک کروموزوم X دارند و آن را از مادر دریافت می‌کنند. اگر کروموزوم X منتقل شده به جنس مذکر معیوب باشد، فرد دچار بیماری همولیز می‌شود.
زنان کمتر دچار این حالت می گردند چون دو کروموزوم X دارند. پس در صورتی که کروموزوم معیوب را از مادر دریافت کنند، تنها ناقل هستند و بیماری در آن‌ها دیده نمی‌شود.
بیماری فاویسم بوسیله مادر ناقل به فرزند مذکر منتقل خواهد شد. در دنیا حدودا ۱۵ درصد افراد مبتلا به فاویسم هستند.

شرایط انجام آزمایش G6PD

برای انجام آزمایش G6PD به نکات زیر دقت کنید:

برای انجام این تست نیازی به ناشتایی ندارید و درضمن محدودیت مراقبتی برای انجام آن اعلام نشده است.
پیش از انجام این تست ورزش نکنید.
در زمان انتقال خون این تست نیز انجام می‌شود.

فاویسم چگونه بروز و پیشرفت می‌کند؟

درصورتی که آنزیم G6PD به میزان کافی در بدن موجود نباشید، سطح NADPH کم شده و گلبولهای قرمز در مقابل مواد اکسید کننده ضعیف می‌شوند.

در این هنگام اگر فرد دارو یا مواد غذایی مانند باقالی که اکسید کننده است را استفاده کند، هموگلوبین موجود در خون نیز اکسید می‌ شود. اگر هموگلوبین اکسید شود در جدار گلبول‌های قرمز خون (RBC) رسوب می‌کند.

بعد از مصرف مواد غذایی و دارویی اکسید کننده در روز‌های اول تا چهارم همولیز رخ می‌دهد. جز باقالا داروهایی مانند داروی آسپرین و فناستین ( نوعی داروی ضد التهاب) هم از جمله موارد اکسید کننده هموگلوبین بشمار می‌روند. چنانچه فرد مبتلا به فاویسم باشد و عفونت یا اسیدوز هم در بدن بوجود بیاید پیشرفت این بیماری سرعت بیشتری خواهد گرفت.

فاویسم به چند دسته تقسیم می‌شود؟

کلاس ۱: در این حالت فرد از کمبود شدید آنزیم رنج می‌برد و دچار آنمی (کم خونی) مزمن نیز هست.
کلاس ۲: بیمار دچار کمبود شدید آنزیم G6PD و همولیز متناوب است.
کلاس ۳: سطح کمبود آنزیم خفیف است و در صورت مصرف مواد اکسید کننده بیماری تشدید می‌شود.
کلاس ۴: کمبود آنزیم چندان قابل توجه نیست و عوارضی به دنبال ندارد.
کلاس ۵: در این حالت افزایش آنزیم وجود دارد اما عوارض و علائمی در فرد دیده نمی‌شود.

تفسیر آزمایش G6PD

درصورتی که آزمایش نشان دهنده افزایش G6PD باشد موارد زیر مطرح می‌شود:

فرد مبتلا به پرکاری تیروئید است.
بیمار مبتلا و ناقل هپاتیت است.
فرد از ترومبوسیتوپنی پورپورا ( نوعی اختلال در انعقاد خون) رنج می‌برد.
درگیری به آنمی مگالوبلاستیک درمان نشده. این بیماری نوعی کم خونی بوده که به دلیل کمبود اسید فولیک یا ویتامین B12 رخ می‌دهد.

چنانچه آزمایش نشان دهنده کاهش سطح طبیعی G6PD باشد موارد زیر مطرح می‌شود:

بروز بیماری همولیتیک غیر ایمونولوژیک در نوزادان.
آنمی همولیتیک ناشی از مصرف داروها یا باقالا.

مقادیر نرمال آزمایش G6PD

میزان سطح نرمال در این آزمایش در بزرگسالان بین ۵/۵ تا ۵/۲۰ واحد در گرم هموگلوبین است.
محدوده نرمال این آنزیم برای نوزادان بین ۱۵/۱۰ تا ۷۱/۱۴ واحد در گرم هموگلوبین قرار دارد.

تست های مرتبط با آزمایش G6PD

عموما همراه با تست G6PD، آزمایش CBC نیز انجام می‌گیرد. آزمایش CBC خود شامل دیگر فاکتورهای موثر در عملکرد خون می باشد و در نتیجه و تشخیص بیماری فاویسم موثر است. تست CBC همان آزمایش شمارش کامل گلبول‌ های خونی می باشد. از این تست به منظور تشخیص بیماری‌ های شایع خونی مانند آنمی و کم خونی، انواع سرطان و کنترل روند درمان بیماری استفاده می‌شود.

علائمی که نشان می دهد سطح G6PD نرمال نیست.

مشاهده زردی به جای سفیدی چشم.
افزایش ضربان قلب بدون فعالیت یا شوک قبلی.
کاهش تمرکز و هوشیاری فرد.
مشاهده لکه‌های تیره یا تیرگی کامل رنگ ادرار.
احساس خستگی و ضعف عمومی بدن بدون فعالیت بدنی سنگین.
بروز تب.
احساس تنگی نفس.
احساس سرگیجه.

آماده سازی
یک حجم از محلول معر ف 4 را با یک حجم از محلول معر ف 2 مخلوط کنید.
نگهداری و پایداری
در صورت نگهداری در دمای 8-2 درجه سانتی گراد و محافظت از نور، کیت تا تاریخ انقضای ذکر شده بر روی جعبه 25-20 درجه سانتی گراد و یک هفته در دمای 8-2 درجه سانتی گراد پایدار است.
بهداشت، ایمنی و دفع مواد زائد
جهت حذ ف و دور ریز تمام پسماندها طبق الزامات قانونی و محلی عمل شود.
برای جلوگیری از آلودگی معرفها، از وسایل تمیز یا یکبار مصر ف استفاده نمایید. هنگام کار از دستکش استفاده کنید. از تماس معرفها با پوست و چشم خودداری کرده و در صورت تماس، موضع را با آب شستشو دهید.

روش انجام آزمایش
ابتدا µL 25 از خون تام را به نیم سی سی (µL 500 )محلول لیز کننده (R3) اضافه کنید و 5 دقیقه در دمای اتاق قرار دهید تا همولیز کامل شود.

نمونه همولیز	20µL
معرف کاری	20µL

مخلوط کنید و 5 دقیقه صبر کنید. جذب نوری اول را تعیین نموده (A1) اختال ف جذب نوری را پس از دقیقه اول (A2) دوم (A3) سوم (A4) چهارم (A5) و پنجم (A6) هر دقیقه نسبت به دقیقه قبل به دست آورید.

ریکاوری

نتایج به دست آمده از آزمون ریکاوری در محدوده Hb g/U 20.7 – 9.2 به شرح زیر می باشد:

Percent recovery	Observed Data	Expected Data
95.70%	2.9 U/g Hb	3.03 U/g Hb
100%	4.4 U/g Hb	4.4 U/g Hb
95.90%	9.4 U/g Hb	9.8 U/G Hb
95.70%	14.9 U/g Hb	15.6 U/g Hb
100%	20.7 U/g Hb	20.7 U/g Hb

نمونه ها
خون تام حاوی EDTA ،هپارین یا (ACD (dextrose citrate-acid .
از آنجا که فعالیت آنزیم G6PD بر اساس غلظت هموگلوبین یا تعداد گلبول های قرمز گزارش می شود، باید غلظت هموگلوبین یا تعداد گلبول های قرمز قبل از انجام آزمایش G6PD مشخص شود.
آنزیم G6PD در گلبول های قرمز به مدت یک هفته در دمای 8-2 درجه سانتی گراد پایدار است.
به هیچ وجه نباید نمونه را فریز کرد.
پس از لیز شدن، نمونه لیز شده فاقد پایداری الزم جهت اندازه گیری فعالیت آنزیم G6PD می باشد و بایستی آزمایش در عرض 41 دقیقه انجام شود.
در نمونه حاوی ACD ،پایداری اریتروسیت در مدت طوالنی حفظ می شود و نتایج شمارش RBC به دست آمده از این نمونه ها در طوالنی مدت (21 روز) از صحت کافی برخوردار است اما در نمونه های هپارینه و حاوی EDTA گلبول قرمز تا 2 روز پایدار است. به همین دلیل در صورت استفاده از نمونه های هپارینه بهتر است نتایج براساس هموگلوبین گزارش شود.

روش انجام آزمایش
ابتدا µL 25 از خون تام را به نیم سی سی (µL 500) محلول لیز کننده (R3) اضافه کنید و 5 دقیقه در دمای اتاق قرار دهید تا همولیز کامل شود.

کالیبراسیون
این روش بر اساس جذب مولی NADPH در طول موج 340nm استاندارد شده است. اندازه گیری میزان افزایش جذب نوری (ΔA) در 340nm متناسب با فعالیت آنزیم می باشد.

محاسبه فعالیت آنزیم در نمونه های غیر از Blood Whole که نیاز به انجام همولیز ندارند:

G6PD (U/L( = ΔA per min × 21704

مثال1:
نتایج به دست آمده از آنالیز نمونه مربوط به یک بیمار به شرح زیر می باشد

RBC: 5.10 × 10/µL
Hb: 15.3 g/dL
ΔA per min at 37°C: 0.0651
G6PD (U/g Hb) = (0.0651 × 4557) / 15.3 = 19.4
G6PD (U/1012RBC) = (0.0651 × 45758) / 5.10 = 581

مثال2:
نتایج به دست آمده از آنالیز نمونه کنترل کیفی شرکت من (بدون نیاز به همولیز) به شرح زیر می باشد

Control low : ΔA per min at 37°C: 0.0331
Control high: ΔA per min at 37°C: 0.0790
G6PD (U/L) control low: 0.0331 × 21704 = 718 U/L
G6PD (U/L) control high: 0.0790 × 21704 = 1714 U/L

دامنه مرجع

U/1012RBC(at 37°C)	U/g Hb (at 37°C)
≤ 290	≤ 10.01	Deficient
290 – 411	10.1 – 14.19	Intermediate
≥ 411	≥ 14.19	Sufficient

دقت
آزمایشها با استفاده از دستگاه اتوآنالایزر در دمای 37 درجه سانتی گراد انجام شده است.

Within-run

(%)CV	Mean (U/L)	n	Level
0.4	717	20	Low
0.2	1713	20	High

Between-run

(%)CV	Mean (U/L)	n	Level
1.3	726	20	Low
0.9	1715	20	High

عوامل مداخله گر

کدورت	کدورت ناشی از تری گلیسیرید تا غلظت dL/mg 200 باعث تداخل نمی شود.
بیلی روبین	بیلی روبین تا غلظت dL/mg 16 باعث تداخل نمی شود.
گلوکز	گلوکز تا غلظت dL/mg 400 باعث تداخل می شود.
هموگلوبین	هموگلوبین تا غلظت L/5g باعث تداخل نمی شود.
اسید آسکوربیک	اسید اسکوربیک تا غلظت dL/mg 20 باعث تداخل نمی شود.