انواع روش های الایزا و مقایسه ی آن ها

روش IEMA و EIA در الایزا

ELISA یک تست سریع (Rapid) برای شناسایی و اندازه گیری آنتی بادی یا آنتی ژن در برابر ویروس ها و باکتری ها و یا مواد دیگر است. در تکنیک الایزا، فاز جامد از یک پلیت ۶ خانه جنس پلی استایرن یا مواد دیگر تشکیل شده است. عملکرد فاز جامد، ثابت کردن آنتی ژن یا آنتی بادی در نمونه است که با اتصال به فاز جامد اتفاق می افتد.

در این روش چنانچه آنتی ژن نشاندار شود، Enzyme Immunoassay) EIA) و اگر آنتی بادی نشاندار شود، Immunoenzymometric Assay) IEMA) نامیده می شود.

ELISA نیز نامی است عمومی برای اینگونه روش ها، که به صورت رایج استفاده می شود .

نشاندار سازی آنتی بادی بجای آنتی ژن در روش IEMA، مزایای متدولوژیک زیادی را به ارمغان می آورد که برخی از مهمترین آن ها عبارتست از:

  1. سهولت نشاندارسازی

در روش EIA ، مولکول های آنتی ژن اغلب از جنس هاپتن بوده که مولکول هایی با جرم مولکولی کمتر از هزار دالتون می باشند؛ لذا محدودیت گروه های عاملی در مولکول های مورد نظر، نشاندارسازی را محدود ساخته و اغلب نیاز به واکنش های تخصصی و پیچیده دارد. اما در روش IEMA، چون نشاندارسازی بر روی مولکول بزرگ آنتی بادی صورت میگیرد که دارای انواع گروه های عملکردی است، نشاندارسازی آن به راحتی با روش های ساده و عمومی امکان پذیر است.

  1. افزایش ویژگی

در روش EIA با توجه به اینکه از یک آنتی بادی برای شناسایی منفرد استفاده شده، درحالی که در روش IEMA استفاده از دو آنتی بادی امکان شناسایی مضاعف را میسر می سازد، از این رو ویژگی IEMA نسبت به EIA بیشتر است.

  1. افزایش حساسیت

در روش IEMA به ازاء تک تک آنالیت ها، کمپلکس نشاندار وجود داشته و همچنین جایگاه های نشاندارسازی بالقوه آن بیشتر است؛ بنابراین، هم به دلیل رابطه یک به یک بین آنالیت و کمپلکس نشاندار و هم بیشتر بودن جایگاه های بالقوه نشاندارسازی، حساسیت روش IEMA نسبت به EIA بیشتر است.

  1. کاهش زمان انکوباسیون

واکنش آنتی ژن و آنتی بادی یک واکنش تعادلی دو طرفه بوده که طبق اصل لوشاتلیه با افزودن هر یک از مواد در یکی از طرفین معادله، تعادل به سمت طرف دیگر پیشرفت می نماید. از این رو، به دلیل اینکه در روش IEMA غالبا رقابت وجود نداشته و برای حصول اطمینان ازکفایت آنتی بادی ها به منظور تشکیل کمپلکس در غلظت بالای آنالیت، همواره مقادیر زیادی از آنتی بادی بکار می رود، در نتیجه غلظت بالای مواد اولیه، سرعت به تعادل رسیدن یا زمان انکوباسیون را کاهش میدهد.

  1. افزایش محدوده عملکرد (Work of range)

محدوده عملکرد که محدوده قابل اندازه گیری برای آنالیت بوده و فاصله بین اولین و آخرین نقطه استاندارد را شامل میشود، در روش IEMA حدود صد برابر بیشتر از EIA است.

  1. کاهش اثر هوک (Effect Hook)

اثر هوک عبارتست از کسب نتایج منفی کاذب در غلظت بالای آنالیت که در واکنش های ایمونولوژی اتفاق می افتد و معادل پدیده پروزون در واکنش های سرولوژی است. در این پدیده غلظت آنالیت که میتواند آنتی ژن یا آنتی بادی باشد، از بالاترین استاندارد نیز بسیار بالاتر بوده و لذا علیرغم زیاد بودن آنتی ژن یا آنتی بادی مورد آزمایش در سرم، نتیجه منفی کاذب حاصل میگردد.

به دلیل نتایج منحرف کننده و نامطلوبی که اثر هوک میتواند بر آزمون های ایمنی سنجی باقی گذارد، تحقیقات زیادی در زمینه شناخت این پدیده و چگونگی خنثی سازی آن انجام شده است.

با توجه به اینکه پدیده هوک در روش EIA به دلیل تک مرحله ای و مستقیم بودن روش آزمایش، شایع تر از روش IEMA می باشد، عدم استفاده از این چنین کیت هایی پیشنهاد میشود. در شرایطی که ناچار به استفاده از چنین کیت هایی باشیم، برای اطمینان از صحت نتیجه، اولاً باید از کیت هایی استفاده شود که محدوده شروع پدیده هوک در آن قید شده باشد و ثانیا بایستی هر جواب منفی را با رقت های بالاتری از همان سرم تکرار کنیم.

البته باید توجه داشت که اگرچه پدیده هوک غالبا در اثر فزونی آنالیت اتفاق می افتد، ولی تحقیقات انجام شده توسط محققان ثابت نموده که منحصرا بالا بودن میزان آنالیت تنها عاملی نیست که در بروز این پدیده دخالت دارد.

عوامل دیگری نیز نظیر توزیع و پراکندگی اپیتوپ ها، وجود اپی توپ های مشابه و یا استفاده از دو آنتی بادی مونوکلونال که بر ضد دو اپی توپ مختلف تهیه شده اند، می تواند در بروز پدیده هوک موثر باشد که نمونه آن نیز ایجاد پدیده هوک در روش های IEMA علیرغم دو مرحله ای بودن آن ها می باشد. علت این اتفاق، در نتیجه استفاده از دو آنتی بادی مونوکلونال بر ضد دو اپی توپ مختلف می باشد.

مقایسه روش های الایزا
ELISA

مزایای روش ELISA نسبت به روش  RIA

  • با تقویت فعالیت آنزیمی حساسیت سنجش قابل افزایش است.
  • معرف ها دارای زمان نگهداری طولانی تری می باشند.
  • سنجش های همزمان چندگانه قابل انجام است.
  • طیف وسیعی از انواع سنجش ها می تواند صورت گیرد.
  • دستگاه ها و ابزار لازم بطور گسترده ای در دسترس است.
  • خطر اشعه در جریان نشاندار کردن ، انجام آزمایش و دفع پسماند های آنها وجود ندارد.
  • روش ها ساده و سریع است و با روش های اتوماتیک قابل انجام است.

معایب روش ELISA نسبت به روش  RIA

اندازه گیری فعالیت آنزیم می تواند به مراتب از اندازه گیری فعالیت برخی رادیو ایزوتوپ ها پیچیده تر باشد.

فعالیت آنزیم می تواند توسط عواملی در نمونه تحت تاثیر قرار گیرد.

مطالب آزمایشگاهی

شرکت پارس پیوند