روش الایزا (ELISA) چیست؟
امروزه آزمایش های سرولوژی بالینی یکی از روش های سریع و آسان در تشخیص بیماری ها می باشد. این آزمایش ها بر اساس اتصال آنتی بادی اختصاصی به آنتی ژن مربوطه صورت می گیرد .
انواع واکنش های Ab _ Ag:
- واکنش ها گروه اول: واکنش های مربوط به اتصال یک Ag به یک Ab است.
- واکنش ها گروه دوم: واکنش های مربوط به اتصال چند Ag به چند Ab و ایجاد شبکه قابل رویت با چشم است.
- واکنش های گروه سوم: مربوط به واکنش Ag و Ab در بدن است مثل PPD
آزمون های سرولوژیک
1. بررسی واکنش های گروه اول: این آزمون ها دارای حساسیت بالا هستند که شامل دونوع تکنیک Immuno Assay مثل IFA ، RIA ،Elisa و تکنیک ImmunobIotting میباشد. ( واکنش Ag و Ab قابل رویت نیست.)
2. بررسی واکنش های گروه دوم: این آزمون ها دارای حساسیت کم هستند و شامل پرسیپیتاسیون، آگلوتیناسیون، فلوکولاسیون و نوترالیزاسیون می باشند. (واکنش Ag و Ab با چشم دیده می شود.)
تکنولوژی الایزا (ELISA)
در این روش بجای رادیو ایزوتوپ برای نشاندار کردن از یک آنزیم استفاده می شود. چنانچه آنتی ژن نشاندار شود، Immunoassay Enzyme) EIA) و اگر آنتی بادی نشاندار شود، Immuno enzymometric Assay) IEMA) نامیده می شود.
ELISA نامی است عمومی برای اینگونه روش ها، که به صورت رایج استفاده می شود. واژه الایزا ELISA، اختصاری از کلمات Enzyme -Linked Immuno sorbent Assay است.
طبقه بندی الایزا
تکنیک الایزا به چند روش تقسیم می شود :
Direct Elisa .1 (الایزای مستقیم)
Indirect Elisa .2 (الایزای غیرمستقیم)
Sandwich Elisa .3 (الایزای ساندویچی)
4. Competitive Elisa (الایزای رقابتی)
Direct ELISA
در این روش آنتی ژن یا آنتی بادی موجود در نمونه ای که باید تشخیص داده شود به طور مستقیم بر سطح فاز جامد کوت می شود و سپس آنتی بادی یا آنتی ژن مکمل آن که نشاندار شده است به سیستم اضافه میشود. در صورت وجود آنتی ژن یا آنتی بادی مورد نظر در نمونه، سیگنال مناسب ایجاد میشود.
این روش مشابه ایمونوفلورسانس مستقیم است اما کاربرد چندانی در کیت های تشخیصی ندارد و بیشتر در کارهای تحقیقاتی استفاده میشود.
Indirect ELISA
این روش برای تعیین آنتی بادی اختصاصی و یا تیتراسیون آنتی بادی در نمونه های سرم مورد استفاده قرار میگیرد. اساس آزمایش بدین نحو است که معمولا سرم رقیق شده به آنتی ژن های کوت شده در فاز جامد (میکرو ول یا چاهک) اضافه میشود.
آنتی ژن کوت شده آنتی ژن اختصاصی مربوط به آنتی بادی است که قرار است در نمونه ردیابی شود.
پس از افزودن نمونه و طی زمان انکوباسیون و یک مرحله شستشو، آنتی هیومن گلوبولین نشاندار شده با آنزیم به چاهک اضافه میشود. بر حسب اینکه چه کلاسی از آنتی بادی برای ردیابی اهمیت دارد، نوع آنتی ایمنوگلوبولین مورد استفاده نیز متفاوت است.
مثلا برای ردیابی آنتی بادی کلاس IgG از آنتی هیومن IgG و برای ردیابی کلاس IgA از آنتی هیومن IgA استفاده میشود.
اختصاصیت سنجش مستقیما توسط آنتی ژن کوت شده در فاز جامد تعیین میشود که ممکن است کاملا خالص و اختصاصی باشد و یا نسبتا خام و غیراختصاصی باشد. سرم حاوی آنتی بادی اختصاصی میتواند در یک بافر برای جلوگیری از جذب غیراختصاصی پروتئین ها و جلوگیری از اشغال نقاط اتصال آنتی ژن رقیق شود. به چنین بافری محلول رقیق کننده نمونه (sample diluent) گفته میشود.
حساسیت و ویژگی چنین روش هایی میتواند با بکارگیری روش Antibody capture با کاهش تداخل اثر آنتی بادی غیراختصاصی بهتر شود.
بهترین مثال ها در مورد این روش تعیین آنتی بادی برعلیه توکسوپلاسما، روبلا، ویروس سیتومگال و هلیکوباکترپیلوری از کلاس های IgM و IgA و IgG در سرم می باشد. البته امروزه برای تعیین IgM بر علیه این عوامل عموما از روش capture استفاده میشود.
در روش capture، آنتی بادی های موجود در نمونه از کلاس IgM به روی چاهک های کوت شده با آنتی هیومن IgM جذب شده و سپس برای تشخیص، از آنتی ژن اختصاصی مربوطه که آنزیم نشاندار شده است و یا آنتی بادی نشاندار ضد آن به صورت مزدوج استفاده می شود.
روش ساندویچ الایزا خود به 2 دسته تقسیم می شود:
الف) روش Ab sandwich یا Ag capture
در این روش یک آنتی ژن در بین 2 آنتی بادی اختصاصی قرار میگیرد. این روش شایع ترین روش الایزا محسوب میشود. در این روش از یک آنتی بادی برای به دام انداختن آنتی ژن بر روی چاهک های الایزا استفاده می شود و آنتی بادی دوم که با آنزیم نشاندار شده است به عنوان شناساگر عمل میکند. قابل ذکر است که در این روش آنتی ژن باید حداقل دارای 2 ناحیه ی آنتی ژنیک متفاوت باشد تا قادر به اتصال به هر 2 آنتی بادی باشد.
مثال های بارز این روش اندازه گیری PSA ، FSH ،LH ،TSH ,HCG و… است.
ب) روش Antibody capture
Ag sandwich or direct Ab capture -a
این روش برای تعیین سنجش آنتی بادی مورد استفاده قرار می گیرد. بدین صورت که از یک آنتی ژن کوت شده بر روی فاز جامد برای به دام انداختن آنتی بادی اختصاصی آن استفاده میشود و همان آنتی بادی از طریق بازوی دیگر خود (Fab)، پذیرای همان آنتی ژن اما به صورت نشاندار میباشد؛ در نتیجه آنتی بادی اختصاصی در بین 2 آنتی ژن ساندویچ میگردد.
در این روش آنتی بادی توتال از هر کلاس ایمونوگلوبولین میسر است و یکی از اختصاصی ترین و حساس ترین روش ها برای تشخیص آنتی بادی در نمونه است. مثال بارز این روش کیت اندازه گیری آنتی بادی علیه پلاسمودیوم ویواکس، ترپونما پالیدوم و HBs Ab می باشد.
Indirect Ag Sandwich or Indirect Ab capture -b
در این روش پس از به دام انداختن آنتی بادی توسط آنتی هیومن گلوبولین کوت شده در کف چاهک ها، با اضافه کردن آنتی ژن اختصاصی و تشکیل کمپلکس از یک آنتی بادی اختصاصی نشاندار بر علیه آنتی ژن، به عنوان سیستم شناساگر استفاده می شود.
Competitive ELISA
در روش های رقابتی اساس سنجش بر رقابت دو آنتی ژن یا دو آنتی بادی (که یکی از آن دو نشاندار است) برای اتصال به لیگاند با مقدار محدود استوار است. اگر هر دو آنالیت نشاندار و غیرنشاندار با هم به سیستم اضافه شوند روش را رقابتی می نامند؛ ولی چنانچه ابتدا آنالیت اضافه شده و پس از یک دوره انکوباسیون آنالیت نشاندار اضافه گردد، روش را مهاری یا بلوکینگ می نامند.
در روش مهاری ممکن است در بین 2 مرحله و قبل از اضافه نمودن آنالیت بعدی شستشو انجام شود یا انجام نشود. مثال بارز روش های رقابتی و مهاری، سنجش T3 و T4 می باشد.
انواع روش های رقابتی عبارتند از:
الف) روش رقابتی یا مهاری برای آنتی ژن:
اساس این روش بر رقابت بین آنتی ژن نشاندار و آنتی ژن موجود در نمونه برای اتصال به یک آنتی بادی اختصاصی کوت شده در چاهک استوار است. در این روش مقدار آنتی بادی کوت شده باید محدود باشد و مولکول سیگنال دهنده همان آنتی ژن نشاندار است.
اساس RIA و EIA کلاسیک به همین روش استوار است. در این روش منحنی پاسخ – دوز به صورت معکوس خواهد بود. بدین معنی که آنالیت نشاندار در حضور مقادیر زیادی از آنالیت غیرنشاندار موجود در نمونه به مقدار کمتری به آنتی بادی متصل میشود و در نتیجه سیگنال هم به وجود خواهد آمد.
محدوده تعیین آنالیت با این روش ممکن است به وسیله استفاده از مولکول نشاندار با فعالیت اختصاصی زیاد تقویت شود اما حداقل مقدار قابل تشخیص (کمترین مقدار از آنالیت که قابل تشخیص خواهد بود) توسط تمایل آنتی بادی مورد استفاده تعیین می شود. با این وجود غلظت های خیلی کم از هاپتن ها عموما توسط همین روش قابل تعیین اند و حساس ترین روشی است که میتواند مقادیر خیلی کم را هم تشخیص دهد.
در برخی از موارد، نشاندار کردن روی خصوصیات هاپتن اثر میگذارد؛ در نتیجه در روش رقابتی برای تعیین آنتی ژن از یک آنتی بادی نشاندار استفاده می شود. در این نوع از سنجش ها این مطلب ضروری است که فاز جامد توسط آنتی ژن با مقدار کم و ثابت پوشیده می شود. در این روش آنالیت موجود در نمونه با آنالیت کوت شده در چاهک برای اتصال به آنتی بادی نشاندار رقابت میکند.
در این روش هم منحنی استاندار معکوس است. از این روش بیشتر برای سنجش به روش کمی لومینسانس استفاده میشود.
ب) روش رقابتی برای آنتی بادی:
دراین روش رقابت بین دو آنتی بادی یکی در نمونه به صورت غیرنشاندار و یکی به صورت نشاندار شده با آنزیم برای اتصال به یک آنتی ژن کوت شده در چاهک صورت می گیرد. بدیهی است که هر چه مقدار آنتی بادی نمونه بیشتر باشد، آنتی بادی نشاندار کمتری به چاهک ها متصل شده و سیگنال نیز کمتر خواهد بود. در نتیجه منحنی استاندارد نیز معکوس میباشد. شاخص ترین مثال این روش اندازه گیری آنتی بادی ضد HBc است.
منابع:
