اساس آزمایش آنتی بادی

تست آنتی بادی کرونا

اساس آزمايش سرولوژي 19COVID بر پايه اتصال آنتي بادي ها به آنتـي ژن هـاي اختصاصـي SARSCoV2 مــي باشــد. اســاس روش هــاي مختلــف ســرولوژي كوويــد-19 شــامل ســنجش هــاي جريــان جــانبي

((Lateral flow Immunochromatographic assay (LFIA)، الايــزا و كمي لومينسانس است. اين سنجش ها در نحوه شناسايي اتصال آنتي بادي-آنتي ژن و نوع آنتي ژن به كار رفتـه بـا هـم متفاوتند. اگر بيمار در برابر 2-SARS  CoVآنتي بادي هايي ايجاد كرده باشد، آنتي بادي هاي مربوطه آنتي ژن ها را تشخيص داده و به آن متصل مي شوند و اين نشانه قرار گرفتن در معرض 2-SARS-CoV است.

نوع آنتي ژن به كار رفته و روش انجام آزمايش سرولوژی

تفسير دقيق آزمايش هاي سرولوژي به ويژگي آنتي ژن آن بستگي دارد. آنتي ژن ها مي توانند پروتئين، پلي ساكاريد يـا ليپيد باشند، اما اگر ويژگي بالايي براي عامل عفونت زا نداشته باشند، احتمال واكنش متقاطع افزايش يافتـه و اطمينـان از نتايج به دست آمده كاهش مي يابد.

  • آنتي ژن هاي ويروسي زير براي تشخيص آنتي بادي هاي 2-SARS-CoV مورد استفاده قرار مي گيرند.

 دو آنتي ژن مهم ويروس 2SARSCoV  كه عليه آن ها آنتي بادي ها توليد مي شود، گليكوپروتئين اسپايك (S) و فسفوپروتئين نوكلئوكپسيد (N) هستند.

  • پروتئين Sبراي ورود ويروس به سلول ميزبان ضـروري اسـت و در سطح ويروسي وجود دارد.
  • پروتئين N : يك پروتئين ايمني زاي بسيار قوي است كه با RNA ويروسي همراه مي باشد.

 

اشكال متعدد پروتئين S مانند:

S كامل (S2+S1)، زير واحد S1 يا دامنه اتصـال گيرنـده (RBD) بـه عنـوان آنتـي ژن مورد استفاده قرار مي گيرند.

زير واحد S2، كه شامل مناطق حفاظت شده بين كرونا ويروس هاست، ويژگي كمتري از RBD  دارد.

پروتئين نوكلئو كپسيد (پروتئينN):

پروتئيني است كه به RNA متصل شده و نقش ساختاري و غير ساختاري را در عفونت 2 -COV-SARS ايفا مي كند. داده ها حاكي از آن اسـت كـه ايـن آنتـي ژن نقـش مهمـي در پـاتوژنز بيماري دارد:

پروتئين اسپايك (پروتئين هاي S):

پروتئين هاي سطحي قارچ مانند منحصر به فردي هستند كه بـه سـلول هـای ميزبان متصل شده و ورود ويروس را تسهيل مي كنند. هر مونومر پروتئين S حاوي دو زير واحد S1 و S2 است كه بـه ترتيب، اتصال و همجوشي غشايي را تسهيل مي كنند. زير واحد هاي S1 و S2 ممكن است بـه صـورت جداگانـه يـا بـه صورت كامل به عنوان آنتي ژن براي آزمايش سرولوژيك استفاده شوند.

دامنه اتصال گيرنده يا  RBD:

بخشي از پروتئين S1 است كه به آنزيم تبديل كننـده آنژيوتانسـين 2 (ACE2)، كه گيرنده 2–SARS-CoV است متصل مي شود.

آنتی ژن مورد استفاده در الایزا

آنتي ژن مورد استفاده در روش هاي الايزا واكنش متقاطع و ويژگي آن را تعيـين مـي كنـد. آنتـي ژن N در بـين كرونـا ويروس ها بيشتر از (S)، و در آنتي ژن هاي اسپايك، RBD بيشتر از S1 يا S كامـل (S2,S1) محافظـت مـي شـوند.

منطقه RBD نسبت به ساير دامنه هاي پروتئين اسپايك بين كرونا ويروس ها كمتر حفاظت شده و داراي ويژگي بالايي است. بنابراين مي تواند به عنوان هدف اصلي براي آنتي بادي هاي ضد SARS-COV-2 به كار رود.

مشـخص شـده است كه آنتي بادي هاي ضد اسپايك مـي تواننـد اتصـال پـروتئين S بـه گيرنـده سـلولي hACE2 كـه واسـطه اتصـال2-SARSCoV و ورود به سلول هاي هدف است را مسدود كنند.

هيچ مدركي مبني بر اين كه آنتي بادي هاي ضـد نوكلئوكپسيد بتوانند مانع ورود ويروس به سلول هاي بدن شوند، وجود ندارد. پروتئين N بـه دليـل قـدرت ايمنـي زايـي بالاي آن و تجمع داخل سلولي قبل از بسته بندي ويروس، كانديد مناسبي براي تشخيص زود هنگام عفونت است.

نگراني عمده در شناسايي آنتي بادي به هنگام استفاده از RBD به جـاي اسـپايك بـا طـول كامـل (S2,S1) ، كـاهش احتمـالي حساسـيت سـنجش اسـت. بـا ايـن حـال، در يـك تحقيـق مشـاهده شـد كـه بـيش از 95 ٪ از بيمـاران مبـتلا بـه، 9SARS-CoV-2 روز پس از شروع علائم آنتي بـادي ضـد RBD را توليـد نمـوده انـد.

سـرم بيمـاران درگيـربـا SARS-COV-2 آنتي بادي هايي دارند كه با دامنه اتصال گيرنده SARS 1-CoV- واكنش متقابل نشان مي دهد. از آنجا كه شيوع 1-  SARS-CoV و MERS- COV  در حال حاضـر در انسـان بسـيار كـم اسـت، واكـنش متقـاطع آنتي بادي SARS-COV-2 با  SARS-COV-1 بعيد است كه چالش هاي تشخيصي ايجاد كند.

همچنين نشـان داده شده كه يك رابطه مشخص بين سطح آنتـي بـادي هـاي RBD در بيمـاران و توانـايي سـرم بيمـار جهـت خنثـي سـازي ويروس SARS-COV-2 وجود دارد. بنابراين يك روش الايزاي ساده مبتني بر RBD مي توانـد ابـزاري مفيـد بـراي شناسايي اهدا كنندگان پلاسماي خون باشد.

روش الايزاي غيـر مسـتقيم (ELISA Indirect)  

روش الايـزاي غيـر مسـتقيم داراي حساسـيت بـالايي بـراي شناسايي آنتي بادي در سرم بيمار است. در اين روش آنتي ژن اختصاصي N  يا S در كـف چاهـك الايـزا متصـل شـده، سپس سرم حاوي آنتي بادي به آن اضافه شده و بر اساس اين كه چه ايزوتايپي را بخواهيم اندازه گيـري نمـاييم از آنتـي هيومن ايمونوگلبولين نشاندار شده با HRP استفاده مي كنيم. يكي از معايب اين روش امكان واكنش متقاطع با آنتـي  ژن ثابت شده در كف چاهك الايزا است كه موجب افزايش سيگنال زمينه مي گردد.

 روش الايزاي كپچر (ELISA Capture)

استفاده از اين روش موجب افزايش ويژگي سنجش مي گـردد. در اين روش از يك آنتي ژن نشاندار مانند (HRP-RBD) استفاده مي شود. چاهك ELISA بـا آنتـي بـادي هـاي ضـد hIgG  يا ضد hIgM اختصاصي به ايزوتايپ انساني از قبل پوشانده شده است.

پس از افزودن سـرم انسـاني و شستشـو، HRP-RBD اضافه شد و پس از آن شستشو و محلول رنگزا اضافه مي گردد. نتايج نشان داده كه اين روش نسـبت بـه الايزاي غير مستقيم حساسيت و ويژگي بيشتري (ويژگي 100٪ و حساسيت 96٪) در بيماران PCR مثبت دارد.

اين آزمايش را به راحتي مي توان با همان قالب براي شناسايي ساير ايزوتايپ ها (IgA ،IgE ،IgD)  يا ساب تايپ ها  (IgG1-4) با اندكي تغيير سازگار كرد. آنتي ژن RBD-HRP در دسترس بوده و پروتكل عملياتي كلي آن نيز وجود دارد. در اين روش به جاي استفاده از RBD-HRP مي توان از پروتئين X با (HRP ،X-HRP) كه در آن X مي تواند پروتئين يا آنتي ژن هاي ديگري از SARS-COV-2 باشد، براي شناسايي آنتي بادي استفاده نمود.

ارزش پيشگويي كننده تست هاي سرولوژيك

همان طور كه قبلا گفته شد تعيين حساسيت و ويژگي آزمايش هاي سرولوژيك به هدفي كه از انجام آن متصور است، بستگي دارد و بايستي قبل از اجراي آن در نظر گرفته شود. براي ارزيابي بيماران علامت دار و تشخيص آن ها حساسيت بالايي لازم است (به طور كلي بيشتر از 90 درصد) در اين حالت كاهش جزئي در ويژگي و وجـود برخـي نتـايج مثبـت كاذب ممكن است قابل تحمل باشد مشروط بر اين كه نتيجه ساير اقدامات تشخيصـي و ارزيـابي هـاي آزمايشـگاهي در نظر گرفته شود زيرا وجود نتايج مثبت كاذب ممكن است به مداخلات، آزمايش ها و درمان هاي غير ضـروري و حتـي قرنطينه فرد منجر گردد. با اين حال اگر آزمايش ها براي حذف محدوديت هاي اجتمـاعي و بازگشـت بـه فعاليـت هـاي عادي به كار گرفته شود بايستي ويژگي بالايي داشته باشد، زيرا نتايج مثبت كاذب افراد غير ايمن را ممكن است به خطر اندازد. بنابراين موارد فوق بايد با توجه به ميزان شيوع بيماري تعيين شوند.

محققان از اين موضوع نگرانند كه ممكن است حساسيت و ويژگي آزمايش سرولوژيك در هنگام استفاده از آن ها در بررسي هاي سرواپيدميولوژيك كمتر از مقدار ادعا شده باشد، زيرا اين آزمايش ها بيشتر در بيماران بستري ارزيابي شده و معلوم نيست كه آيا آن ها مي توانند سطوح پايين آنتي بادي را در سرم بيماران خفيف و بدون علامت تشخيص دهنـد يا خير؟

عوامل موثر در نتیجه ی تست آنتی بادی

ارزش پيشگويي كنندگي مثبت و منفي به ويژگـي هـاي عملكـردي آزمـايش (ويژگـي و حساسـيت) و همچنـين شـيوع بيماري بستگي دارد. در مناطقي كـه شـيوع بيمـاري كوويـد-19 كـم اسـت، خطـر بـروز نتـايج مثبـت كـاذب آزمـايش سرولوژي، حتي اگر ويژگي بالايي داشته باشد بسيار بيشتر است. بنابراين، ميزان آلودگي بايد در نظر گرفته شود و بـراي تأييد نتايج در جمعيت هايي كه شيوع بيماري كم دارند، آزمايش هاي مكرر ممكن است مفيد واقع گردد.

تعیین حساسیت و ویژگی تست های سرولوژی

خصوصيات عملكردي آزمايش هاي سرولوژي (حساسيت و ويژگي) بـا اسـتفاده از مجموعـه مشخصـي از نمونـه هـاي منفي و مثبت تعيين مي شود. علاوه بر اين، ارزش پيشگويي كنندگي آزمون نيز بايد در نظر گرفته شود زيـرا مقـادير آن بر نتايج كلي آزمايش تأثير مي گذارد.

ارزش پيشگويي كننده مثبـت  (PPV) بـدين معنـي است كـه بيمـار بـا نتيجـه  آزمايش مثبت، آنتي بادي داشته باشند.

 ارزش پيشگويي كننده منفي (NPV) اين احتمال را نشان مي دهد كه افـراد بـا  نتيجه آزمايش منفي واقعا آنتي بادي منفي باشند.

مقادير پيشگويي كننده مثبت و منفي با درصد واقعي افـراد آنتـي بـادي مثبت در جمعيت مورد آزمايش (شيوع، احتمال پيش آزمون) و حساسيت و ويژگي آزمـايش تعيـين مـي شـود. مـثلا در يك جامعه با شيوع بالاي بيماري، ارزش پيشگويي كننده مثبت افزايش مي يابد

 – بدين معنـي كـه احتمـالا افـرادي كـه آزمايش مثبت آنتي بادي دارند، واقعاً آنتي بادي مثبت هستند

 – از ايـن رو وقتـي از يـك آزمـايش در جمعيتـي اسـتفاده مي شود كه شيوع بيماري در آنجا پايين است، ارزش پيشگويي كننده مثبت كاهش مـي يابـد زيـرا نتـايج مثبـت كـاذب بيشتر است چون احتمال پيش از آزمون كم است. به همين ترتيب، ارزش پيشـگويي منفـي نيـز تحـت تـأثير شـيوع قـرار دارد. در يك محيط شيوع بالا، ارزش پيشگويي كننده منفي كاهش مي يابد در حالي كه در يك محيط با شـيوع پـايين، افزايش مي يابد. در بيشتر كشورها شيوع آنتي بادي 2-SARSCoV از 5٪ تا 25٪ متغير است، به طوري كه آزمـايش در اين مرحله ممكن است منجر به نتايج نادرست شود يعني نتايج مثبت كاذب بيشتر و نتايج منفي كاذب كمتر است.

در همه گيري فعلي، به حداكثر رساندن ويژگي و در نتيجه ارزش پيشگويي كننده مثبـت در يـك بررسـي سـرولوژيك ارجح است، زيرا كه شيوع آنتي بادي ها در برخي جوامع ممكن است پايين باشد. به عنوان مثال، در جمعيتي كـه شـيوع بيماري در آن 5 ٪ است، آزمايشي با حساسيت 90 ٪ و ويژگي 95 ٪ ارزش پيشگويي كننده مثبت 49 ٪ را به همراه خواهـد داشت.

به عبارت ديگر، كمتر از نيمي از آزمايش هاي مثبت واقعاً آنتي بادي دارند. از طرف ديگر، اگر همين آزمـايش در يك جمعيت با شيوع بيماري بيشتر از 50٪ انجام شود، ارزش پيش بينـي كننـدگي مثبـت بيشـتر از 95 ٪ خواهـد بـود، بدين معني كه كمتر از 5 ٪ افراد (يك در هر 20 نفر كه آزمايش آنتي بادي مثبت دارنـد) ، نتيجـه آزمـايش آن هـا مثبـت كاذب خواهد بود.

براي بهبود ارزش پيش بيني كننده مثبت مي توان از سه استراتژي زير استفاده نمود

  1. انتخاب آزمايشي با ويژگي بسيار بالا (شايد 5 /99٪ يا بيشتر) در جمعيت هاي آزمايش شـده بـا شـيوع 5 ٪ ارزش پيشگويي كننده مثبت بالايي خواهد داشت.
  2. راهكار ديگر تمركز بر روي افـرادي اسـت كـه احتمـال پـيش از آزمـون بـالايي بـراي آنتـي بـادي هـاي ضـد 2-SARSCoV را دارند، ماننـد افـرادي كـه سـابقه بيمـاري 19-COVID داشـته و يـا علائـم آن را ذكـر مي كنند.
  3. رويكرد سوم استفاده از يـك الگـوريتم آزمـايش متعامـد (ارتوگونـال) اسـت كـه در آن افـرادي كـه در ابتـدا آزمايش مثبت دارند، با يـك آزمـايش دوم مجـددا آزمـايش شـوند. الگـوريتم هـاي متعامـد عمومـا مبتنـي بـر آزمايش يك نمونه بيمار با دو آزمايش هستند كه هر كدام داراي خصوصيات ويژه اي در طراحـي هسـتند (بـه عنوان مثال، آنتي ژن هاي هدف يا فرمت انجام آزمايش) مثلا:
  • استفاده از دو روش الايزاي يكسان (مثلا الايزاي غيـر مسـتقيم) كـه يكـي داراي آنتـي ژن N و ديگـري داراي آنتي ژن S است.
  • استفاده از دو روش الايزاي متفاوت (مثلا الايـزاي كپچـر و الايـزاي غيـر مسـتقيم بـا آنتـي ژن هـاي يكسـان يـا متفاوت)
  • استفاده از دو آزمايش مختلف مانند الايزا و كمي لومينسانس با آنتي ژن هاي يكسان يا متفاوت.

الگوريتم ها مي توانند با حداكثر ويژگي در عين حفظ حداكثر حساسيت طراحي شوند. به عنوان مثال، در مـورد بـالا بـا شيوع جمعيت 5٪، اگر نمونه هايي مثبت در مرحله اول با روش متفـاوت دوم كـه داراي 90 ٪ حساسـيت و 95 ٪ ويژگـي است آزمايش شوند، مي توان ارزش پيشگويي كننده مثبت 95 ٪ را به دسـت آورد. عملكـرد الگـوريتم متعامـد بـه طـور سيستماتيك مورد ارزيابي قرار نگرفته است اما مي توان با استفاده از يك نرم افزار محاسباتي آن را تخمين زد.

 

نتیجه

با توجه به توزيع جغرافيايي مناسب آزمايشگاه هاي خصوصي و دولتي در سطح كشور، هم اكنون امكان دسترسي به آزمايش هاي سرولوژي در اقصي نقاط كشور به صورت مناسـبي وجـود دارد و مـي تـوان بـا طراحـي يـك فرآيند تعريف شده و مشخص و استفاده از بستر الكترونيك سامانه هاي موجود در نظام سلامت و به صورت متمركز، به نحو مناسبي و با كمترين هزينه به جمع آوري اطلاعات مورد نياز پرداخت. از اين نظر با توجه به طيف وسيع كاربردهاي ارزيابي هـاي سـرولوژيك در مـديريت بيمـاري كرونـا در كشـور، اسـتفاده از ظرفيـت آزمايشـگاه پزشـكي خصوصـي مي تواند به عنوان يك راهبرد موثر، در اين زمينه ها راهگشا باشد.

همچنين لازم است كه مسـئولين سياسـت گـذاران و مسـئولين در وزارت بهداشـت، درمـان و آمـوزش پزشـكي و سـاير سازمان ها و نهاد هاي مربوطه با تشويق و راهنمايي شركت هاي دانش بنيان و ارائه تسـهيلات لازم بـه آن هـا زمينـه سـاز حركت به سمت توسعه روش هاي سرولوژيك با حساسيت و ويژگي بالا شده تا بتوان با افزايش كارايي ايـن روش هـا، به نحو موثرتري در شيوع يابي و بررسي هاي سرواپيدميولوژيك و كمك به تشخيص بيماران، استفاده نمود.

منبع:

انجمن علمی دکتری علوم آزمایشگاهی تشخیص طبی ایران