باکتری های خانواده انتروباکتریاسه و سایر باکتری های تخمیر کننده گلوکز ابتدا گلوکز را متابولیزه کرده و ایجاد اسید می کنند. اسید تولیدی موجب تغییر رنگ معرف فنل رد از قرمز به رنگ زرد می شود، به این ترتیب پس از ۶ ساعت از انکوباسیون TSI هر دو بخش ,Butt Slant (شیب و عمق محیط) زرد می شود. اما اگر ارگانیسم تخمیر کننده گلوکز نباشد، قسمت شیب و عمق قرمز رنگ می ماند. 

از آنجایی که مقدار گلوکز محیط کم است پس از این مدت مقدار گلوکز به دلیل مصرف شدن توسط باکتری ها کاهش یافته و تنها باکتری هایی که قادر به تخمیر لاکتوز یا سوکروز باشند به عمل تخمیر و تولید اسید ادامه میدهند و چون مقدار لاکتوز و سوکروز زیاد است به راحتی این کار را انجام خواهند داد. فرمول این واکنش A/A نوشته می شود و Acid over Acid خوانده می شود.

درصورت عدم مصرف لاکتوز محیط توسط ارگانیسم مورد آزمایش، انرژی مورد نیاز خود را از مصرف پروتئین ها و اسیدهای آمینه به دست می آورد که در شرایط هوازی محصولات جانبی قلیایی نظیر آمونیاک را به وجود می آورند و موجب تغییر رنگ فنل رد به رنگ اولیه خود یعنی قرمز رنگ می شوند.

به این ترتیب بعد از ۱۸ تا ۲۴ ساعت انکوباسیون لوله محیط کشت KIA حاوی یک باکتری تخمیر کننده گلوکز که فاقد توانایی تخمیر لاکتوز است، مشاهده میشود که در قسمت slant قرمز رنگ و در قسمت عمقی زردرنگ است. این واکنش را ALK/A) Alkaline over Acid) می خوانند.

تولید گاز و سولفید هیدروژن

اگر باکتری در حین تخمیر، گاز CO2 نیز ایجاد کند، موجب بروز شکستگی در محیط با ایجاد حباب می شود و گاهی مقدار گاز تولیدی زیاد است و محیط را به سمت بالا می راند.
باکتری هایی که دارای آنزیم desulfurase می باشند، قادرند اسید آمینه های حاوی سولفور را مانند سیستئین و متیونین را دی سولفوره کرده و ایجاد گاز H2S نمایند که این گاز در اثر ترکیب با آهن موجود در محیط ایجاد رسوب سیاه رنگ FeS می نماید. بنابراین هرکجا در این لوله سیاهی دیده شود، نشان دهنده به وجود آمدن گاز H2S می باشد.

نکات:

• هنگام بیرون آوردن نیدل از ته لوله، شکستگی در محیط جامد ایجاد نشود، زیرا ممکن است این ترک با تولید گاز توسط باکتری اشتباه شود.
• سر لوله باید شل باشد تا جریان هوا آزادانه عبور نماید.
• لوله ها پس از ۱۸ تا ۲۴ ساعت بررسی شوند، وگرنه ممکن است رنگ لوله ها عوض شود.
• در هر دو محیط TSI ،KIA مقدار محدودی گلوکز و دو برابر غلظت گلوکز از قندهای لاکتوز و سوکروز وجود دارد.