اساس آزمایش آنتی بادی

اساس آزمایش سرولوژی 19–COVID بر پایه اتصال آنتی بادی ها به آنتـی ژن هـای اختصاصـی SARS–CoV–2 مــی باشــد. اســاس روش هــای مختلــف ســرولوژی کوویــد-19 شــامل ســنجش هــای جریــان جــانبی

((Lateral flow Immunochromatographic assay (LFIA)، الایــزا و کمی لومینسانس است. این سنجش ها در نحوه شناسایی اتصال آنتی بادی-آنتی ژن و نوع آنتی ژن به کار رفتـه بـا هـم متفاوتند. اگر بیمار در برابر 2-SARS  CoVآنتی بادی هایی ایجاد کرده باشد، آنتی بادی های مربوطه آنتی ژن ها را تشخیص داده و به آن متصل می شوند و این نشانه قرار گرفتن در معرض 2-SARS-CoV است.

نوع آنتی ژن به کار رفته و روش انجام آزمایش سرولوژی

تفسیر دقیق آزمایش های سرولوژی به ویژگی آنتی ژن آن بستگی دارد. آنتی ژن ها می توانند پروتئین، پلی ساکارید یـا لیپید باشند، اما اگر ویژگی بالایی برای عامل عفونت زا نداشته باشند، احتمال واکنش متقاطع افزایش یافتـه و اطمینـان از نتایج به دست آمده کاهش می یابد.

• آنتی ژن های ویروسی زیر برای تشخیص آنتی بادی های 2-SARS-CoV مورد استفاده قرار می گیرند.

 دو آنتی ژن مهم ویروس 2–SARS–CoV  که علیه آن ها آنتی بادی ها تولید می شود، گلیکوپروتئین اسپایک (S) و فسفوپروتئین نوکلئوکپسید (N) هستند.

• پروتئین S:  برای ورود ویروس به سلول میزبان ضـروری اسـت و در سطح ویروسی وجود دارد.
• پروتئین N : یک پروتئین ایمنی زای بسیار قوی است که با RNA ویروسی همراه می باشد.

اشکال متعدد پروتئین S مانند:

S کامل (S2+S1)، زیر واحد S1 یا دامنه اتصـال گیرنـده (RBD) بـه عنـوان آنتـی ژن مورد استفاده قرار می گیرند.

زیر واحد S2، که شامل مناطق حفاظت شده بین کرونا ویروس هاست، ویژگی کمتری از RBD  دارد.

پروتئین نوکلئو کپسید (پروتئینN):

پروتئینی است که به RNA متصل شده و نقش ساختاری و غیر ساختاری را در عفونت 2 -COV-SARS ایفا می کند. داده ها حاکی از آن اسـت کـه ایـن آنتـی ژن نقـش مهمـی در پـاتوژنز بیماری دارد:

پروتئین اسپایک (پروتئین های S):

پروتئین های سطحی قارچ مانند منحصر به فردی هستند که بـه سـلول هـای میزبان متصل شده و ورود ویروس را تسهیل می کنند. هر مونومر پروتئین S حاوی دو زیر واحد S1 و S2 است که بـه ترتیب، اتصال و همجوشی غشایی را تسهیل می کنند. زیر واحد های S1 و S2 ممکن است بـه صـورت جداگانـه یـا بـه صورت کامل به عنوان آنتی ژن برای آزمایش سرولوژیک استفاده شوند.

دامنه اتصال گیرنده یا  RBD:

بخشی از پروتئین S1 است که به آنزیم تبدیل کننـده آنژیوتانسـین 2 (ACE2)، که گیرنده 2–SARS-CoV است متصل می شود.

آنتی ژن مورد استفاده در الایزا

آنتی ژن مورد استفاده در روش های الایزا واکنش متقاطع و ویژگی آن را تعیـین مـی کنـد. آنتـی ژن N در بـین کرونـا ویروس ها بیشتر از (S)، و در آنتی ژن های اسپایک، RBD بیشتر از S1 یا S کامـل (S2,S1) محافظـت مـی شـوند.

منطقه RBD نسبت به سایر دامنه های پروتئین اسپایک بین کرونا ویروس ها کمتر حفاظت شده و دارای ویژگی بالایی است. بنابراین می تواند به عنوان هدف اصلی برای آنتی بادی های ضد SARS-COV-2 به کار رود.

مشـخص شـده است که آنتی بادی های ضد اسپایک مـی تواننـد اتصـال پـروتئین S بـه گیرنـده سـلولی hACE2 کـه واسـطه اتصـال2-SARS–CoV و ورود به سلول های هدف است را مسدود کنند.

هیچ مدرکی مبنی بر این که آنتی بادی های ضـد نوکلئوکپسید بتوانند مانع ورود ویروس به سلول های بدن شوند، وجود ندارد. پروتئین N بـه دلیـل قـدرت ایمنـی زایـی بالای آن و تجمع داخل سلولی قبل از بسته بندی ویروس، کاندید مناسبی برای تشخیص زود هنگام عفونت است.

نگرانی عمده در شناسایی آنتی بادی به هنگام استفاده از RBD به جـای اسـپایک بـا طـول کامـل (S2,S1) ، کـاهش احتمـالی حساسـیت سـنجش اسـت. بـا ایـن حـال، در یـک تحقیـق مشـاهده شـد کـه بـیش از 95 ٪ از بیمـاران مبـتلا بـه، 9SARS-CoV-2 روز پس از شروع علائم آنتی بـادی ضـد RBD را تولیـد نمـوده انـد.

سـرم بیمـاران درگیـربـا SARS-COV-2 آنتی بادی هایی دارند که با دامنه اتصال گیرنده SARS 1-CoV- واکنش متقابل نشان می دهد. از آنجا که شیوع 1-  SARS-CoV و MERS- COV  در حال حاضـر در انسـان بسـیار کـم اسـت، واکـنش متقـاطع آنتی بادی SARS-COV-2 با  SARS-COV-1 بعید است که چالش های تشخیصی ایجاد کند.

همچنین نشـان داده شده که یک رابطه مشخص بین سطح آنتـی بـادی هـای RBD در بیمـاران و توانـایی سـرم بیمـار جهـت خنثـی سـازی ویروس SARS-COV-2 وجود دارد. بنابراین یک روش الایزای ساده مبتنی بر RBD می توانـد ابـزاری مفیـد بـرای شناسایی اهدا کنندگان پلاسمای خون باشد.

روش الایزای غیـر مسـتقیم (ELISA Indirect)  

روش الایـزای غیـر مسـتقیم دارای حساسـیت بـالایی بـرای شناسایی آنتی بادی در سرم بیمار است. در این روش آنتی ژن اختصاصی N  یا S در کـف چاهـک الایـزا متصـل شـده، سپس سرم حاوی آنتی بادی به آن اضافه شده و بر اساس این که چه ایزوتایپی را بخواهیم اندازه گیـری نمـاییم از آنتـی هیومن ایمونوگلبولین نشاندار شده با HRP استفاده می کنیم. یکی از معایب این روش امکان واکنش متقاطع با آنتـی  ژن ثابت شده در کف چاهک الایزا است که موجب افزایش سیگنال زمینه می گردد.

 روش الایزای کپچر (ELISA Capture)

استفاده از این روش موجب افزایش ویژگی سنجش می گـردد. در این روش از یک آنتی ژن نشاندار مانند (HRP-RBD) استفاده می شود. چاهک ELISA بـا آنتـی بـادی هـای ضـد hIgG  یا ضد hIgM اختصاصی به ایزوتایپ انسانی از قبل پوشانده شده است.

پس از افزودن سـرم انسـانی و شستشـو، HRP-RBD اضافه شد و پس از آن شستشو و محلول رنگزا اضافه می گردد. نتایج نشان داده که این روش نسـبت بـه الایزای غیر مستقیم حساسیت و ویژگی بیشتری (ویژگی 100٪ و حساسیت 96٪) در بیماران PCR مثبت دارد.

این آزمایش را به راحتی می توان با همان قالب برای شناسایی سایر ایزوتایپ ها (IgA ،IgE ،IgD)  یا ساب تایپ ها  (IgG1-4) با اندکی تغییر سازگار کرد. آنتی ژن RBD-HRP در دسترس بوده و پروتکل عملیاتی کلی آن نیز وجود دارد. در این روش به جای استفاده از RBD-HRP می توان از پروتئین X با (HRP ،X-HRP) که در آن X می تواند پروتئین یا آنتی ژن های دیگری از SARS-COV-2 باشد، برای شناسایی آنتی بادی استفاده نمود.

ارزش پیشگویی کننده تست های سرولوژیک

همان طور که قبلا گفته شد تعیین حساسیت و ویژگی آزمایش های سرولوژیک به هدفی که از انجام آن متصور است، بستگی دارد و بایستی قبل از اجرای آن در نظر گرفته شود. برای ارزیابی بیماران علامت دار و تشخیص آن ها حساسیت بالایی لازم است (به طور کلی بیشتر از 90 درصد) در این حالت کاهش جزئی در ویژگی و وجـود برخـی نتـایج مثبـت کاذب ممکن است قابل تحمل باشد مشروط بر این که نتیجه سایر اقدامات تشخیصـی و ارزیـابی هـای آزمایشـگاهی در نظر گرفته شود زیرا وجود نتایج مثبت کاذب ممکن است به مداخلات، آزمایش ها و درمان های غیر ضـروری و حتـی قرنطینه فرد منجر گردد. با این حال اگر آزمایش ها برای حذف محدودیت های اجتمـاعی و بازگشـت بـه فعالیـت هـای عادی به کار گرفته شود بایستی ویژگی بالایی داشته باشد، زیرا نتایج مثبت کاذب افراد غیر ایمن را ممکن است به خطر اندازد. بنابراین موارد فوق باید با توجه به میزان شیوع بیماری تعیین شوند.

محققان از این موضوع نگرانند که ممکن است حساسیت و ویژگی آزمایش سرولوژیک در هنگام استفاده از آن ها در بررسی های سرواپیدمیولوژیک کمتر از مقدار ادعا شده باشد، زیرا این آزمایش ها بیشتر در بیماران بستری ارزیابی شده و معلوم نیست که آیا آن ها می توانند سطوح پایین آنتی بادی را در سرم بیماران خفیف و بدون علامت تشخیص دهنـد یا خیر؟

عوامل موثر در نتیجه ی تست آنتی بادی

ارزش پیشگویی کنندگی مثبت و منفی به ویژگـی هـای عملکـردی آزمـایش (ویژگـی و حساسـیت) و همچنـین شـیوع بیماری بستگی دارد. در مناطقی کـه شـیوع بیمـاری کوویـد-19 کـم اسـت، خطـر بـروز نتـایج مثبـت کـاذب آزمـایش سرولوژی، حتی اگر ویژگی بالایی داشته باشد بسیار بیشتر است. بنابراین، میزان آلودگی باید در نظر گرفته شود و بـرای تأیید نتایج در جمعیت هایی که شیوع بیماری کم دارند، آزمایش های مکرر ممکن است مفید واقع گردد.

تعیین حساسیت و ویژگی تست های سرولوژی

خصوصیات عملکردی آزمایش های سرولوژی (حساسیت و ویژگی) بـا اسـتفاده از مجموعـه مشخصـی از نمونـه هـای منفی و مثبت تعیین می شود. علاوه بر این، ارزش پیشگویی کنندگی آزمون نیز باید در نظر گرفته شود زیـرا مقـادیر آن بر نتایج کلی آزمایش تأثیر می گذارد.

ارزش پیشگویی کننده مثبـت  (PPV) بـدین معنـی است کـه بیمـار بـا نتیجـه  آزمایش مثبت، آنتی بادی داشته باشند.

 ارزش پیشگویی کننده منفی (NPV) این احتمال را نشان می دهد که افـراد بـا  نتیجه آزمایش منفی واقعا آنتی بادی منفی باشند.

مقادیر پیشگویی کننده مثبت و منفی با درصد واقعی افـراد آنتـی بـادی مثبت در جمعیت مورد آزمایش (شیوع، احتمال پیش آزمون) و حساسیت و ویژگی آزمـایش تعیـین مـی شـود. مـثلا در یک جامعه با شیوع بالای بیماری، ارزش پیشگویی کننده مثبت افزایش می یابد

 – بدین معنـی کـه احتمـالا افـرادی کـه آزمایش مثبت آنتی بادی دارند، واقعاً آنتی بادی مثبت هستند

 – از ایـن رو وقتـی از یـک آزمـایش در جمعیتـی اسـتفاده می شود که شیوع بیماری در آنجا پایین است، ارزش پیشگویی کننده مثبت کاهش مـی یابـد زیـرا نتـایج مثبـت کـاذب بیشتر است چون احتمال پیش از آزمون کم است. به همین ترتیب، ارزش پیشـگویی منفـی نیـز تحـت تـأثیر شـیوع قـرار دارد. در یک محیط شیوع بالا، ارزش پیشگویی کننده منفی کاهش می یابد در حالی که در یک محیط با شـیوع پـایین، افزایش می یابد. در بیشتر کشورها شیوع آنتی بادی 2-SARS–CoV از 5٪ تا 25٪ متغیر است، به طوری که آزمـایش در این مرحله ممکن است منجر به نتایج نادرست شود یعنی نتایج مثبت کاذب بیشتر و نتایج منفی کاذب کمتر است.

در همه گیری فعلی، به حداکثر رساندن ویژگی و در نتیجه ارزش پیشگویی کننده مثبـت در یـک بررسـی سـرولوژیک ارجح است، زیرا که شیوع آنتی بادی ها در برخی جوامع ممکن است پایین باشد. به عنوان مثال، در جمعیتی کـه شـیوع بیماری در آن 5 ٪ است، آزمایشی با حساسیت 90 ٪ و ویژگی 95 ٪ ارزش پیشگویی کننده مثبت 49 ٪ را به همراه خواهـد داشت.

به عبارت دیگر، کمتر از نیمی از آزمایش های مثبت واقعاً آنتی بادی دارند. از طرف دیگر، اگر همین آزمـایش در یک جمعیت با شیوع بیماری بیشتر از 50٪ انجام شود، ارزش پیش بینـی کننـدگی مثبـت بیشـتر از 95 ٪ خواهـد بـود، بدین معنی که کمتر از 5 ٪ افراد (یک در هر 20 نفر که آزمایش آنتی بادی مثبت دارنـد) ، نتیجـه آزمـایش آن هـا مثبـت کاذب خواهد بود.

برای بهبود ارزش پیش بینی کننده مثبت می توان از سه استراتژی زیر استفاده نمود

1. انتخاب آزمایشی با ویژگی بسیار بالا (شاید 5 /99٪ یا بیشتر) در جمعیت های آزمایش شـده بـا شـیوع 5 ٪ ارزش پیشگویی کننده مثبت بالایی خواهد داشت.
2. راهکار دیگر تمرکز بر روی افـرادی اسـت کـه احتمـال پـیش از آزمـون بـالایی بـرای آنتـی بـادی هـای ضـد 2-SARS–CoV را دارند، ماننـد افـرادی کـه سـابقه بیمـاری 19-COVID داشـته و یـا علائـم آن را ذکـر می کنند.
3. رویکرد سوم استفاده از یـک الگـوریتم آزمـایش متعامـد (ارتوگونـال) اسـت کـه در آن افـرادی کـه در ابتـدا آزمایش مثبت دارند، با یـک آزمـایش دوم مجـددا آزمـایش شـوند. الگـوریتم هـای متعامـد عمومـا مبتنـی بـر آزمایش یک نمونه بیمار با دو آزمایش هستند که هر کدام دارای خصوصیات ویژه ای در طراحـی هسـتند (بـه عنوان مثال، آنتی ژن های هدف یا فرمت انجام آزمایش) مثلا:

• استفاده از دو روش الایزای یکسان (مثلا الایزای غیـر مسـتقیم) کـه یکـی دارای آنتـی ژن N و دیگـری دارای آنتی ژن S است.

• استفاده از دو روش الایزای متفاوت (مثلا الایـزای کپچـر و الایـزای غیـر مسـتقیم بـا آنتـی ژن هـای یکسـان یـا متفاوت)

• استفاده از دو آزمایش مختلف مانند الایزا و کمی لومینسانس با آنتی ژن های یکسان یا متفاوت.

الگوریتم ها می توانند با حداکثر ویژگی در عین حفظ حداکثر حساسیت طراحی شوند. به عنوان مثال، در مـورد بـالا بـا شیوع جمعیت 5٪، اگر نمونه هایی مثبت در مرحله اول با روش متفـاوت دوم کـه دارای 90 ٪ حساسـیت و 95 ٪ ویژگـی است آزمایش شوند، می توان ارزش پیشگویی کننده مثبت 95 ٪ را به دسـت آورد. عملکـرد الگـوریتم متعامـد بـه طـور سیستماتیک مورد ارزیابی قرار نگرفته است اما می توان با استفاده از یک نرم افزار محاسباتی آن را تخمین زد.

نتیجه

با توجه به توزیع جغرافیایی مناسب آزمایشگاه های خصوصی و دولتی در سطح کشور، هم اکنون امکان دسترسی به آزمایش های سرولوژی در اقصی نقاط کشور به صورت مناسـبی وجـود دارد و مـی تـوان بـا طراحـی یـک فرآیند تعریف شده و مشخص و استفاده از بستر الکترونیک سامانه های موجود در نظام سلامت و به صورت متمرکز، به نحو مناسبی و با کمترین هزینه به جمع آوری اطلاعات مورد نیاز پرداخت. از این نظر با توجه به طیف وسیع کاربردهای ارزیابی هـای سـرولوژیک در مـدیریت بیمـاری کرونـا در کشـور، اسـتفاده از ظرفیـت آزمایشـگاه پزشـکی خصوصـی می تواند به عنوان یک راهبرد موثر، در این زمینه ها راهگشا باشد.

همچنین لازم است که مسـئولین سیاسـت گـذاران و مسـئولین در وزارت بهداشـت، درمـان و آمـوزش پزشـکی و سـایر سازمان ها و نهاد های مربوطه با تشویق و راهنمایی شرکت های دانش بنیان و ارائه تسـهیلات لازم بـه آن هـا زمینـه سـاز حرکت به سمت توسعه روش های سرولوژیک با حساسیت و ویژگی بالا شده تا بتوان با افزایش کارایی ایـن روش هـا، به نحو موثرتری در شیوع یابی و بررسی های سرواپیدمیولوژیک و کمک به تشخیص بیماران، استفاده نمود.

منبع:

انجمن علمی دکتری علوم آزمایشگاهی تشخیص طبی ایران