کاربرد تست های سرولوژی و PCR برای تشخیص ویروس 

تست آنتی بادی کرونا

در پاسخ به شیوع بیماری کووید-۱۹(19-COVID)، ناشی از ویروس SARSCoV-2، آزمایش های متعددی جهت تشخیص بیماری حاد، ردیابی تماس، تشخیص عفونت های بدون علامت و ارزیابی ایمنی جمعی مورد نیاز است. در حالی که PCR، آزمایش استاندارد در بیماری حاد است، آزمایش های سرولوژیک با توجه به شیوع گسترده بیماری، جهت رفع نیازهای تشخیصی مورد توجه قرار گرفته و توسعه یافته اند.

برخلاف آزمایش PCR که ویژگی بالایی دارد، واکنش متقاطع یک چالش بزرگ برای آزمایش آنتی بادی 19-COVID است. با توجه به این که ۶ کرونا ویروس دیگر که انسان را آلوده می کنند نیز وجود دارد، توسعه روش های سرولوژیک با ویژگی بالا در شناسایی بیماران آلوده از اهمیت خاصی برخوردار خواهد بود.

در طی چند روز پس از انتشار ژنوم ویروس SARS-CoV-2، آزمایش های PCR به سرعت در خط مقدم برای تشخیص بیماران مبتلا به پنومونی حاد در چین و در سطح جهانی به مرحله ی اجرا درآمد. با گسترش بیماری واضح بود که آزمایش PCR به تنهایی نمی تواند پاسخگوی نیاز های این بیماری مانند ردیابی تماس گذشته نگر، بررسی میزان بیماران بدون علامت و ارزیابی ایمنی جمعی باشد.

مزیت های آزمایش های سرولوژی در اپیدمی کرونا ویروس 2

ELISA

سندرم تنفسی شدید حاد کروناویروس۲ (2-SARS-CoV) و پاندمی حاصل از آن، از چالش های تشخیصی مهم به شمار می رود. کاربرد اصلی آزمایش سرولوژی، شناسایی افرادی است که قبلا به SARS-CoV-2 مبتلا شده اند.

از این دانش می توان برای هدایت مطالعات اپیدمیولوژیک و شیوع سرمی و همچنین تسهیل ردیابی تماس استفاده کرد. همچنین ممکن است آزمایش های سرولوژی برای شناسایی اهدا کنندگان احتمالی پلاسمای خون و ارزیابی پاسخ ایمنی نسبت به واکسن ها مورد استفاده قرار گیرد و در نهایت، امکان استفاده از آزمایش های سرولوژیک در تشخیص بیماران علامت دار یا بدون علامت 19-COVID که RT-PCR آن ها منفی بوده و یا این آزمایش را انجام نداده باشند، وجود دارد.

انجام آزمایش های سرولوژیک با کیت های تایید شده، می تواند در شناسایی افرادی که ممکن است به درمان نیاز داشته یا برای پیشگیری از گسترش عفونت، باید خود را ایزوله نمایند، کمک کننده باشد. عدم تشخیص افراد مبتلا به کووید-۱۹ در صورت وجود ابتلا (نتیجه منفی کاذب)، ممکن است باعث به تعویق افتادن درمان شده و همچنین خطر گسترش بیشتر عفونت را به دیگران به همراه داشته باشد. شناسایی نادرست کووید-۱۹ در صورت عدم وجود بیماری (نتیجه مثبت کاذب) ممکن است منجر به انجام آزمایش بیشتر، درمان و جدا سازی غیر ضروری شخص بیمار شود.

شناسایی صحیح افرادی که قبلا کووید-۱۹ داشته اند، در اندازه گیری گسترش بیماری، ارزیابی موفقیت جداسازی و به طور بالقوه در شناسایی افراد ایمن اهمیت خاصی دارد.

مسئله ی مهم این است که با انتخاب یک روش با ویژگی بالا و همچنین با آزمایش جمعیت ها و افرادی که دارای احتمال بالایی مبنی بر آلودگی قبلی با (احتمال پیش آزمون بالا ) دارند، نتایج آزمایش مثبت کاذب را به حداقل برسانیم.

روش دیگر استفاده از الگوریتم متعامد است. بدین معنی که وقتی ارزش پیشگویی کننده ی مثبت یک آزمون واحد کم است، از دو آزمایش مستقل برای افزایش ارزش پیش بینی کنندگی آزمایش استفاده نماییم.

زمان مثبت شدن آزمایش های سرولوژیک

یکی از مواردی که موجب می شود آزمایش های سرولوژیک زیر سوال قرار گیرند، نتایج منفی آن در بیمارانی است که علائم بالینی یا رادیولوژی مثبت دارند. به نظر می رسد در بیشتر موارد این نتایج منفی کاذب به دلیل درخواست آزمایش در زمان نامناسب (عمدتا کمتر از یک هفته از شروع بیماری) باشد.

مطالعات نشان می دهند که سرو کانورژن بیماری کووید-۱۹ بسیار شبیه سایر عفونت های حاد ویروسی است؛ بدین معنی که با به حداکثر رسیدن غلظت IgM غلظت IgG شروع به افزایش می کند. با این حال مطالعات نشان دادند که افزایش تیتر IgM و IgG نسبت به سایر ویروس های تنفسی کندتر بوده که احتمالا بیانگر پاتولوژی نسبتا هتروژن این ویروس است.

مورد دیگری که در برخی مقالات به آن استناد شده این است که سروکانورژن در بیماران کووید-۱۹ ممکن است به صورت سرو کانورژن معمول (تولید IgM و سپس (IgG ، سرو کانورژن همزمان (تولید همزمان IgM و IgG) و سروکانورژن معکوس (تولید IgG و سپس IgM) باشد. این موضوع می تواند تفسیر آزمایش های سرولوژیک را پیچیده نماید. از طرفی در ۳-۲ درصد بیماران ممکن است پاسخ ایمنی ایجاد نشود (non responder) و یا با تاخیر ایجاد شود (late responder) که باید مورد توجه همکاران گرامی قرار گیرد.

زمان درخواست و انجام آزمایش های سرولوژیک بسیار مهم بوده و اگر از آن ها در زمان مناسب استفاده نشود، جواب های قابل قبولی حاصل نمی گردد. در صورت امکان به خصوص در شرایطی که افراد علائم بالینی کمتری را نشان میدهند باید تجزیه و تحلیل داده ها ادامه یافته و بیماران را در مدت زمان طولانی تزی مورد بررسی قرار داد.

در یک مطالعه کوهورت نتایج تجمیع شده با استفاده از نمونه ی 8526 بیمار مبتلا به بیماری کووید-19 و استفاده از روش های سرولوژیک کمی لومینسانس، الایزا و روش جریان جانبی (LFIA) برای اندازه گیری IgG، IgM، IgA، آنتی بادی های توتال و IgG/IgM نشان داد که همگی طی هفته اول شروع علائم بیماری، حساسیت پایینی دارند (همگی کمتر از % 30.1)، در هفته دوم حساسیت آزمایش ها افزایش یافته و در هفته سوم به بالاترین مقدار خود می رسند.

حساسیت ترکیبی IgG/IgM به ترتیب در:

هفته اول: ۱ تا ۷ روز بعد از شروع علائم معادل ۳۰.۱ ٪ (4 .21 تا 7 .40 با محدوده اطمینان 95٪)

هفته دوم: ۸ تا ۱۴ روز بعد از شروع علائم معادل ۷۲.۲ ٪ ( 63.5 تا 5. 79 با محدوده اطمینان 95%)

هفته سوم: ۱۵ تا ۲۱ روز بعد از شروع علائم معادل ۹۱/۴ ٪ (87.0 تا 4 .94 با محدوده اطمینان 95٪) بود.

برآورد برای بیش از سه هفته، بر اساس حجم کمتری از نمونه و مطالعات بنا شده بودند.

هفته های چهارم و پنجم: برای روزهای ۲۱ تا ۳۵، حساسیت های ترکیبی IgG/IgM معادل ۹۶/۰% (6 .90 تا %3 .98 با محدوده اطمینان ۹۵٪) بودند.

مطالعات کافی برای تخمین حساسیت آزمایش ها برای بیش از ۳۵ روز از شروع علائم وجود نداشت. ویژگی ارائه شده در ۳۵ مطالعه برای کلیه آنتی بادی ها، بیشتر از ۹۸٪ بوده و در محدوده مورد انتظاری است که به طور معمول رخ می دهد.

در یک مطالعه دیگر، کینتیک پاسخ های IgM و IgG اختصاصی ضد آنتی ژن های N و S در بیماران مبتلا به Covid-19 پس از شروع علائم مورد بررسی قرار گرفت.

نتیجه ی بررسی ها

در این مطالعه 130 نمونه خون از 38 بیمار مبتلا به Covid-19 مورد آزمایش قرار گرفت و بررسی ها نشان داد که:

– با اندازه گیری همزمان آنتی بادی های N-IgM ،N-IgG ،S-IgM و S-IgG میتوان تا 75 درصد عفونت را در هفته ی اول تشخیص داد.

– اندازه گیری همزمان N-IgM + N-IgG یا N-IgG + S-IgG میتواند تا 94/7 درصد عفونت را در هفته ی دوم تشخیص دهد.

– در هفته ی سوم پس از شروع علائم، میزان مثبت شدن آن برای N-IgG و S-IgG به 100% رسید.

در مقابل، درصد موارد مثبت برای N-IgM و S-IgM در برخی بیماران در نتیجه ی سوئیچ ایزوتایپ IgM به IgG کاهش می یابد، که ممکن است به تولید آنتی بادی های موثر تری که میتوانند از عفونت ویروسی جلوگیری کنند، کمک کند.

هنگام مقابله با شیوع بیماری های عفونی مانند 19-COVID، توسعه سریع سنجش های تشخیصی بخش مهمی از پاسخ سیستم های بهداشتی است. آزمایش های مولکولی، عمدتا PCR، بسیار سریع تر توسعه می یابند، اما قادر به پاسخگویی به تمام نیازهای شیوع نیستند.

سرولوژی می تواند با پاسخ آنتی بادی در مرحله اولیه عفونت، تشخیص مبتنی بر PCR را تکمیل کند، که به ویژه در مورد آنتی بادی های IgM صادق است. مهم تر از همه، سرولوژی نقش مهمی را در ردیابی تماس، اپیدمیولوژی و ارزیابی میزان شیوع سرولوژی و طول عمر ایمنی ایجاد شده (در صورت وجود)، دارد. این امر به ویژه در زمینه ایمنی جمعی در 19-COVID بسیار حائز اهمیت است.

یک روش آزمایش شناسایی آنتی بادی باید بسیاری از ویژگی های زیر را داشته باشد:

  • سریع (هم برای توسعه و هم برای کاربرد)
  • دارای حساسیت و ویژگی بالا
  • انجام آسان و بی خطر برای کاربر
  • ارزان و قابل حمل

متأسفانه، چنین آزمایش “کاملی” هنوز وجود ندارد. بنابراین، هدف عملی این است که آزمایشی را انتخاب کرده و به کار ببریم که با هدف ما متناسب باشد.

به نظر می رسد با شیوع هر چه بیشتر بیماری کووید-۱۹ و از طرفی تولید واکسن در آینده روش های مولکولی قادر به پاسخگویی به نیاز های تشخیصی کشور نبوده و استفاده از روش های سرولوژیک جدید اجتناب ناپذیر است.

در این حالت به نظر می رسد روش مناسب برای شناسایی آنتی بادی های ضد 2-SARSCoV روش الایزای کپچر (capture Elisa) با آنتی ژن N و S و یا هر دو باشد که می تواند ایزوتایپ ها و ساب تایپ های ایمونوگلبولین ها را نیز شناسایی نماید.

همچنین با استفاده از بررسی های شیوع یابی، می توان در مورد کل افراد آلوده، از جمله عفونت هایی که احتمالا شناسایی نشده اند، اطلاعات مناسبی کسب نمود و تخمینی از میزان جمعیتی که هنوز آلوده نشده اند به دست آورد.

منبع:

انجمن علمی دکتری علوم آزمایشگاهی تشخیص طبی ایران